KGF对电离辐射后十二指肠中CTGFBcl-2基因表达的影响

原雅艺 任越 张睿凤 刘红艳 董娟聪 张忠新 左雅慧

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KGF对电离辐射后十二指肠中CTGFBcl-2基因表达的影响

    通讯作者: 左雅慧, yahuiz@163.com
  • 基金项目:

    太原市小店区科技项目 201401S08

The influence of KGF on CTGF and Bcl-2 gene in duodenal tissue induced by radiation

    Corresponding author: Yahui Zuo, yahuiz@163.com
  • Fund Project: Taiyuan-xiaodian Technology Projects 201401S08

  • 摘要: 目的观察角质细胞生长因子(KGF)对电离辐射后十二指肠结缔组织生长因子(CTGF)、凋亡相关基因Bcl-2表达的影响,初步探讨KGF在肠道损伤中的分子机制。方法将昆明小鼠按随机数表法分为对照组、照射组、治疗组,每组10只。对照组不给予照射,照射组与治疗组给予剂量率为0.678 Gy/min、吸收剂量8 Gy的腹腔γ射线照射;治疗组在照射前2 d及照射后3 d均腹腔注射KGF,给药量为6 mg/kg。照射后第15天处死小鼠,取十二指肠组织做病理切片并观察病理表现;采用荧光定量PCR方法检测十二指肠组织中KGFCTGFBcl-2基因的表达水平。计量资料以x±s表示;两组间差异采用独立样本t检验,P < 0.05表示差异有统计学意义。结果对照组十二指肠肠绒毛、隐窝结构完整,排列整齐;照射组十二指肠出现绒毛萎缩、变短或脱落,部分腺窝和绒毛处可见少量凋亡细胞;治疗组肠绒毛组织结构完整,腺窝可见少量凋亡细胞。照射组十二指肠组织中KGFCTGFBcl-2基因表达量上调,与对照组相比差异具有统计学意义(t=-125.55、-6.55、-6.69,均P < 0.05)。与照射组相比,治疗组CTGF基因表达量显著下调、Bcl-2基因表达量显著上调,差异均有统计学意义(t=4.89,-20.96,均P < 0.05)。结论KGF可能通过下调CTGF基因修复电离辐射造成的损伤,并且可能通过调节Bcl-2凋亡相关基因的表达水平来降低细胞凋亡。
  • 图 1  电离辐射诱导小鼠肠道损伤的十二指肠病理切片图(苏木精-伊红染色, ×200)

    Figure 1.  Pathological section of duodenal injury induced by ionizing radiation in mice (hematoxylin-eosin staining, ×200)

    图 2  γ射线照射对小鼠十二指肠组织KGF基因mRNA表达水平的影响(n=10)

    Figure 2.  Effect of KGF mRNA expression levels in duodenal injury induced by γ-ray (n=10)

    图 3  KGF对小鼠十二指肠CTGF基因mRNA表达水平的影响(n=10)

    Figure 3.  Effects of KGF on expression of CTGF gene mRNA in duodenum (n=10)

    图 4  KGF对小鼠十二指肠Bcl-2基因mRNA表达水平的影响(n=10)

    Figure 4.  Effects of KGF on expression of Bcl-2 gene mRNA in duodenum (n=10)

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出版历程
  • 收稿日期:  2016-12-26
  • 刊出日期:  2017-03-25

KGF对电离辐射后十二指肠中CTGFBcl-2基因表达的影响

    通讯作者: 左雅慧, yahuiz@163.com
  • 030006 太原, 中国辐射防护研究院放射医学与环境医学所
基金项目:  太原市小店区科技项目 201401S08

摘要: 目的观察角质细胞生长因子(KGF)对电离辐射后十二指肠结缔组织生长因子(CTGF)、凋亡相关基因Bcl-2表达的影响,初步探讨KGF在肠道损伤中的分子机制。方法将昆明小鼠按随机数表法分为对照组、照射组、治疗组,每组10只。对照组不给予照射,照射组与治疗组给予剂量率为0.678 Gy/min、吸收剂量8 Gy的腹腔γ射线照射;治疗组在照射前2 d及照射后3 d均腹腔注射KGF,给药量为6 mg/kg。照射后第15天处死小鼠,取十二指肠组织做病理切片并观察病理表现;采用荧光定量PCR方法检测十二指肠组织中KGFCTGFBcl-2基因的表达水平。计量资料以x±s表示;两组间差异采用独立样本t检验,P < 0.05表示差异有统计学意义。结果对照组十二指肠肠绒毛、隐窝结构完整,排列整齐;照射组十二指肠出现绒毛萎缩、变短或脱落,部分腺窝和绒毛处可见少量凋亡细胞;治疗组肠绒毛组织结构完整,腺窝可见少量凋亡细胞。照射组十二指肠组织中KGFCTGFBcl-2基因表达量上调,与对照组相比差异具有统计学意义(t=-125.55、-6.55、-6.69,均P < 0.05)。与照射组相比,治疗组CTGF基因表达量显著下调、Bcl-2基因表达量显著上调,差异均有统计学意义(t=4.89,-20.96,均P < 0.05)。结论KGF可能通过下调CTGF基因修复电离辐射造成的损伤,并且可能通过调节Bcl-2凋亡相关基因的表达水平来降低细胞凋亡。

English Abstract

  • 放射性肠损伤(radiation enteritis,RE)是盆腔、腹腔等肿瘤进行放疗后常见的并发症,肠道正常组织对射线的耐受性较肿瘤组织差,放疗可造成正常组织的放射性损伤,形成RE,其发生率可达5%~17%[1-2]。RE的发病机制复杂,目前仍无有效的临床治疗手段。角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor,KGF)从属于成纤维细胞生长因子家族(FGFs),参与组织器官发育、促进细胞分化、增殖及创伤愈合[3],具有抗凋亡作用,在肿瘤的发生、发展中起重要作用[4]。研究表明,KGF预防给药可以明显降低辐射引起的小肠组织损伤[5]。而关于电离辐射作用后对小鼠十二指肠组织KGF基因是否有影响以及KGF对十二指肠放射损伤修复的分子机制还需进一步研究。我们通过研究电离辐射作用后小鼠十二指肠组织KGF表达的变化及其对电离辐射作用后结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)基因和凋亡相关基因Bcl-2表达的影响,进一步揭示KGF在防治RE中的分子机制,为其预防及治疗提供理论依据。

    • KGF(重庆富进生物医药有限公司);动物组织总RNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司);Prime ScriPtTM RT reagent Kit和SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ实时荧光定量PCR试剂(大连宝生物工程有限公司)。60Co治疗机(GWGP-80,中国核动力研究院)。

    • SPF级昆明小鼠,雌雄各半,6~8周龄,体重26~28 g,购于中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心,生产许可证号:SCXK(京)2014-0013,饲养于中国辐射防护研究院GLP中心动物实验室。

      将实验动物按照随机数表法分为对照组、照射组和治疗组,每组10只,雌雄各半。治疗组于照射前2 d及照射后3 d腹腔注射KGF,给药剂量为6 mg/kg,对照组和照射组仅注射生理盐水。

    • 对照组不给予照射,照射组与治疗组均接受腹腔8 Gy照射。照射源为60Co治疗机,照射野为全腹(胸骨剑突至耻骨联合),源皮距80 cm,剂量率为0.678 Gy/min。

    • 照射后第15天,将各实验组小鼠空腹12 h后颈椎脱臼处死,解剖小鼠取出完整的十二指肠组织,4%甲醛溶液固定1周后,经无水乙醇脱水、石蜡包埋后制作RE病理切片,苏木精-伊红染色法进行染色。

    • 完整的十二指肠组织加入裂解液研磨,提取总RNA,反转录cDNA,利用实时荧光定量PCR分析KGF对CTGFBcl-2基因mRNA表达水平的影响。对照组基因表达量为1,以△△Ct法进行相对定量分析各个基因mRNA水平。

    • 实验数据采用统计学分析软件IBM SPSS Statistics V21.0进行分析。计量资料符合正态分布,以x±s表示;两组间差异采用独立样本t检验。P < 0.05表示差异有统计学意义。

    • 光镜下观察,对照组十二指肠肠绒毛、隐窝结构完整,排列整齐(图 1中A);照射组十二指肠病理结果出现绒毛萎缩、变短或脱落,肠腔内充满坏死脱落的组织,腺窝可见较多凋亡细胞(图 1中B);治疗组肠绒毛组织结构完整,腺窝可见少量凋亡细胞(图 1中C),这表明KGF能够有效减少放射性损伤。

      图  1  电离辐射诱导小鼠肠道损伤的十二指肠病理切片图(苏木精-伊红染色, ×200)

      Figure 1.  Pathological section of duodenal injury induced by ionizing radiation in mice (hematoxylin-eosin staining, ×200)

    • KGF有修复受损黏膜的功能,我们利用8 Gy γ射线照射小鼠腹腔后,十二指肠组织中KGF基因表达量显著增高,是对照组的38倍(图 2),差异有统计学意义(t=-125.55,P < 0.05),这表明机体通过KGF的高表达来修复电离辐射造成的损伤。

      图  2  γ射线照射对小鼠十二指肠组织KGF基因mRNA表达水平的影响(n=10)

      Figure 2.  Effect of KGF mRNA expression levels in duodenal injury induced by γ-ray (n=10)

    • 电离辐射可进一步通过炎性相关因子引起肠上皮细胞的损伤,治疗组CTGF基因表达与照射组相比显著下调,差异有统计学意义(t=4.89,P < 0.05);但照射组、治疗组中CTGF基因表达量均高于对照组,差异有统计学意义(t=-6.55,-3.10,均P < 0.05),结果见图 3

      图  3  KGF对小鼠十二指肠CTGF基因mRNA表达水平的影响(n=10)

      Figure 3.  Effects of KGF on expression of CTGF gene mRNA in duodenum (n=10)

    • 利用荧光定量PCR检测凋亡相关基因Bcl-2,结果显示,KGF给药后凋亡相关基因Bcl-2表达量与照射组相比显著上调,差异有统计学意义(t=-20.96,P < 0.05),且照射组与治疗组中Bcl-2基因表达量均显著高于对照组(t=-6.69、-40.65,均P < 0.05),这表明KGF对细胞凋亡起到了抑制作用,结果见图 4

      图  4  KGF对小鼠十二指肠Bcl-2基因mRNA表达水平的影响(n=10)

      Figure 4.  Effects of KGF on expression of Bcl-2 gene mRNA in duodenum (n=10)

    • KGF从属于成纤维细胞生长因子(FGFs)家族,又称FGF-7,参与组织器官发育、促进上皮细胞生长增殖及创伤愈合、具有抗凋亡作用,在肿瘤的发生、发展中起重要作用[3-4]。通常KGF在损伤修复过程中大量表达,外用能有效地促进创面再上皮化[6]。我们检测了电离辐射照射后小鼠十二指肠组织中KGF基因mRNA表达水平,结果显示,电离辐射能够诱导实验动物自身KGF基因表达水平显著升高,这是因为在辐射刺激下,成纤维细胞通过分泌KGF促进细胞的增殖、迁移以及黏膜上皮细胞的再生,以减轻放射损伤。Krishnan等[7]给予葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的肠道损伤小鼠KGF治疗,显微镜下也观察到隐窝完整、上皮轻度缺损以及炎症浸润减轻,说明KGF具有改善和缓解溃疡,减轻损伤的功效。同时,我们通过病理切片能够观察到,给予KGF的治疗组肠绒毛组织结构完整,而照射组肠绒毛萎缩、变短、脱落明显,这也说明KGF能够有效降低放射性损伤,进一步揭示KGF在放射性十二指肠损伤防护作用中的分子机制。

      CTGF通过激活Ras/Raf/ERK等信号通路进一步促进成纤维细胞分裂增殖及胶原沉积,最终促进纤维化的发生与发展[8]。CTGF同时具有诱导凋亡的作用,还可以专一介导转化因子β1的促纤维化作用[9-10]。有文献报道,CTGF作为介导转化因子β1的下游效应介质,在生理状态下几乎不表达,而在肺纤维化过程中表达明显升高,且与肺纤维化程度呈正相关[11]。同时CTGF还可以通过自分泌的方式增强肠道肌纤维母细胞的活化,引起辐射剂量依赖的胶原合成增加促进纤维化[12]。从研究结果发现,电离辐射能够诱导CTGF基因相对表达量升高,而KGF治疗组与照射组相比,CTGF基因表达显著下调,说明KGF能够有效抑制肠损伤的纤维化进程,对RE起到有效的防护作用。刘小菁等[13]利用RNA干扰技术来抑制CTGF基因的表达,发现能够明显抑制人肺成纤维细胞的增殖及表型转化。通常在生理状态下,CTGF几乎不表达,而在纤维化过程中其表达水平明显增高,且与纤维化程度呈正相关[11, 14],而抑制CTGF的表达能阻止纤维化系列反应进程[15-16]。因此,CTGF的表达水平能够有效地反映KGF对肠损伤的修复情况。

      正常肠上皮细胞存在凋亡现象,通过清除衰老细胞来维持上皮的完整性,是肠上皮细胞更新的生理过程[17]Bcl-2基因是重要的凋亡相关基因,能够抑制或阻断多种因素引起的细胞凋亡。本研究结果显示,γ射线照后15 d小鼠十二指肠组织Bcl-2基因表达显著升高,这可能是由于细胞进入恢复期,细胞凋亡逐渐降低导致的。病理结果也显示,照射组肠绒毛处可见凋亡细胞,通过高表达Bcl-2基因来抑制凋亡。KGF具有抗凋亡的作用,可通过抑制凋亡相关因子的表达和增加Bcl-2的表达来减少细胞凋亡。Wildhaber等[18]研究KGF对凋亡的作用,发现营养缺乏致肠上皮细胞凋亡的小鼠中,KGF降低了细胞的凋亡,且上调了Bcl-2 mRNA的表达。同时我们发现,治疗组与照射组相比,Bcl-2基因表达显著上调,同时,光镜下观察治疗组只可见少量凋亡细胞,这主要是由于KGF对凋亡的抑制作用造成的。

      综上所述,KGF能够有效降低生物放射性损伤,并可能通过下调CTGF基因修复电离辐射造成的损伤,通过调节凋亡相关基因Bcl-2的表达水平来降低细胞凋亡。我们认为KGF可减轻辐射引起的肠损伤,在RE防护中起到了一定作用,提示KGF有望成为新的放射防护药物,为RE的预防及治疗提供了实验依据,但深入的分子机制仍需进一步研究。

参考文献 (18)

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