以血管生成为分子靶点的放射性核素显像分子探针在肿瘤个体化用药中的应用

刘晓梅 魏玲格 张芳

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以血管生成为分子靶点的放射性核素显像分子探针在肿瘤个体化用药中的应用

    通讯作者: 刘晓梅, ky121@163.com
  • 基金项目:

    河北财政厅优秀人才项目 361005

Targeting angiogenesis of radionuclide imaging molecular probes for tumor individualized medicine

    Corresponding author: Xiaomei Liu, ky121@163.com ;
  • 摘要: 血管生成对肿瘤生长至关重要,以肿瘤血管为靶点的抗血管生成治疗日益受到重视,但抗血管生成疗法的机制以及治疗后产生的耐药性尚不明确。无创性放射性核素分子显像可阐明基本的药物机制以及耐药通路,并通过治疗前和治疗期间的靶点量化表达实现个体化的抗血管生成治疗。笔者重点讨论在血管生成过程中4个关键蛋白质,即血管内皮生长因子(VEGF)及其受体、整合素αvβ3、细胞外基质纤连蛋白、基质金属蛋白酶(MMP)的表达在放射性核素标记分子显像探针发展中的作用及其在个体化抗血管生成疗法中的应用。
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出版历程
  • 收稿日期:  2017-05-11
  • 刊出日期:  2017-09-01

以血管生成为分子靶点的放射性核素显像分子探针在肿瘤个体化用药中的应用

    通讯作者: 刘晓梅, ky121@163.com
  • 050051 石家庄, 河北医科大学第三医院核医学科
基金项目:  河北财政厅优秀人才项目 361005

摘要: 血管生成对肿瘤生长至关重要,以肿瘤血管为靶点的抗血管生成治疗日益受到重视,但抗血管生成疗法的机制以及治疗后产生的耐药性尚不明确。无创性放射性核素分子显像可阐明基本的药物机制以及耐药通路,并通过治疗前和治疗期间的靶点量化表达实现个体化的抗血管生成治疗。笔者重点讨论在血管生成过程中4个关键蛋白质,即血管内皮生长因子(VEGF)及其受体、整合素αvβ3、细胞外基质纤连蛋白、基质金属蛋白酶(MMP)的表达在放射性核素标记分子显像探针发展中的作用及其在个体化抗血管生成疗法中的应用。

English Abstract

  • 血管生成在肿瘤的生长、转移中发挥重要作用,是恶性肿瘤的标志之一。在肿瘤血管生成的多步级联过程中,已确定多处潜在的生物作用靶点,包括血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、整合素αvβ3、细胞因子、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)MMP-2和MMP-9等。如何将这些分子靶点作为放射性核素显像探针应用到抗肿瘤血管生成的个体化治疗中日益受到科研人员的重视[1]

    • 贝伐单抗于2004年被批准使用,随后其他的抗血管生成靶向小分子药物,如帕唑帕尼、索拉菲尼、舒尼替尼等也在临床上开始使用。抗肿瘤血管生成治疗相较于以肿瘤细胞为目标的化学治疗的优越性是显而易见的:抗血管生成治疗的抗瘤谱较广;药物不需穿透血管,易进入肿瘤区;靶向作用稳定,耐药可能性小;组织毒性小,不易影响其他生理过程等。但抗血管生成治疗目前也存在一些问题,有待进一步阐述,如:抑制血管生成的机制是什么,对抗血管生成治疗敏感或耐药的生物标记是什么。了解这些,才能掌握患者在肿瘤耐药、肿瘤异质性及一般治疗反应上的差异,有助于实现肿瘤患者的个体化用药[2]

      肿瘤学上的个体化用药是指专门为个体患者设计的化疗和(或)靶向治疗的最佳组合疗法。理想状态下,这种治疗可根据患者的遗传学(如VEGF型)和肿瘤异质性进行治疗,包括确定血管生成的范围、血管生成的通路(是否为VEGF独立型、血管生成对该肿瘤是否必需)、哪些通路是活跃的并有蛋白过度表达等[3]。收集上述信息并对血管生成过程中的关键蛋白质(生物标记)进行诊断性测试,不仅可以在治疗前实现患者分层,而且在治疗过程中可以通过监测这些指标来调整药物、用药剂量和用药时间,从而达到个体化治疗的目的。目前,最常用的生物标记检查方法之一是肿瘤活检,但是这一方法具有侵入性,并且在技术上具有挑战性,此外,肿瘤往往存在病变内部和病变之间的异质性,因此活检容易出现抽样误差,而且有可能错失转移性肿瘤细胞。根据实体瘤疗效评价标准测定肿瘤的大小也不足以监测抗血管生成疗法的治疗反应,因为在治疗时,尽管血管生成已被抑制,但肿瘤通常不会马上缩小。肿瘤血管生成分子靶向成像技术可以明确分子靶点的表达水平及其在肿瘤中的位置,是监测抗血管生成疗效并调整用药的理想工具[4]

    • 特定的放射性核素标记分子显像探针可以为监测抗血管生成靶向治疗以及治疗前患者的分层提供依据。这种分子显像具有无创、不受限于肿瘤的类型和位置的特点,它可以通过动态显像监测肿瘤的治疗反应并获得功能参数,实现药物作用靶点的可视化。分子显像探针的结合量是一种复合参数,与分子靶点的表达水平有关,同时也由血流量和渗透性决定,这使其成为预测抗血管生成疗效最有力的工具。

      核医学包含两种主要的显像模式:SPECT和PET,与其他成像技术相比,这两种显像模式具有更高的灵敏度。本文将重点讨论以VEGF、整合素αvβ3为靶点的分子显像示踪剂在肿瘤个体化治疗中的应用,同时讨论纤连蛋白的胞外域B(extracellular domain of fibrin-B ,ED-B)、MMP分子靶点显像的可行性。

    • VEGF有许多亚型,其中VEGF121和VEGF165是VEGF的分泌型,能够在内皮细胞上与VEGF受体特异结合。制备以血管内皮细胞生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)为靶点的探针时,需要考虑到VEGF会与VEGFR1和VEGFR2结合。由于大部分促血管生成信号只有在VEGF与VEGFR2 结合时才会释放,因此VEGFR1通常被认为是VEGF诱骗受体[5]

      Cai等[6]标记出64Cu-1,4,7,10,-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸-血管内皮生长因子121(64Cu-1,4,7,10,-4 n heterocyclic dodecane-1,4,7,10-4 carboxylic acid-vascular endothelial growth factor,64Cu-DOTA-VEGF121),其与非标记的VEGF121具有相似的亲和性,半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)分别为1.66 nmol/L和1.02 nmol/L,对裸鼠恶性胶质瘤细胞株(U87MG)行micro PET显像,裸鼠移植瘤可快速、特异、显著地摄取64Cu-DOTA-VEGF121{肿瘤摄取显像剂的平均体积65 mm3;每克组织的放射性计数(14.9±0.7)% ID/g}。进一步的研究表明,在以阻断VEGFR为机制的抗血管生成药物治疗后的卵巢癌异种移植裸鼠体内,64Cu-DOTA-VEGF121的肿瘤摄取明显降低,从而证实,64Cu-DOTA-VEGF121可用于评价以阻断VEGFR为机制的抗血管生成的疗效[7]。Blankenberg 等[8]通过螯合剂肼基烟酰胺(hydrazino-nicotinamide,HYNIC)与有半胱氨酸结合修饰的二聚体或单链血管内皮生长因子(single-chain VEGF,scVEGF)结合,然后用99Tcm标记,从而实现荷瘤裸鼠模型体内的肿瘤血管成像以及环磷酰胺治疗后(T/NT由12.3±5.0降低至1.03±0.18)的治疗反应监测。Levashova等[9]使用99Tcm -HYNIC-scVEGF监测舒尼替尼在原位乳腺肿瘤模型中的治疗反应,结果证实,在体外,舒尼替尼不影响VEGFR2介导的99Tcm -HYNIC-scVEGF摄取;在体内,使用4日量的舒尼替尼(每次80 mg/kg,每日1次)后,示踪剂99Tcm -HYNIC-scVEGF的摄取减少2.2倍至2.6倍,治疗停止后,示踪剂的摄取在3 d之内增加,结果表明,99Tcm-HYNIC-scVEGF 显像可以监测治疗反应中VEGFR的动态变化。Blankenbeng等[10]使用99Tcm-HYNIC-scVEGF 对帕唑帕尼(每次100 mg/kg,每日2次)治疗人结肠癌细胞株(HT29)移植瘤的治疗反应进行显像,治疗5 d后,肿瘤部位摄取99Tcm-HYNIC-scVEGF显著减少,然而治疗15 d后,肿瘤部位摄取99Tcm-HYNIC-scVEGF又转而增多,免疫组织化学检测结果证实肿瘤血管再生,提示肿瘤产生耐药性。因此99Tcm-HYNIC-scVEGF连续显像也可监测药物治疗的耐药性。

      以上所述的示踪剂是基于VEGF亚型的,也有研究者对基于抗VEGF抗体的放射性示踪剂进行评估。Nagengast等[11]报道了一种更有前景的方法,即使用放射性核素标记的贝伐单抗进行无创的VEGF显像。在人类卵巢肿瘤细胞株(SKOV-3)异种移植的动物模型中,使用89Zr-贝伐单抗作为显像剂进行PET显像,注射89Zr-贝伐单抗后72 h肿瘤显像最清晰。在动物模型中,89Zr-雷珠单抗也有成为监测舒尼替尼抗血管生成治疗反应的标志物的潜力[12]。由于分子质量较小并且可以快速清除,89Zr-雷珠单抗可在注射后(24 h)更早地进行显像,这一特点使它比89Zr-贝伐单抗更适合于监测治疗后VEGF表达的快速变化。

      Stollman等[13]在临床上使用111In-贝伐单抗对VEGF表达进行显像。对12例结、直肠癌患者行111In-贝伐单抗显像,其中发现9例肝转移病灶;14例肾细胞癌患者使用111In-贝伐单抗对VEGF表达进行显像研究[14],患者肿瘤部位有111In-贝伐单抗摄取,其中9例使用索拉非尼(每次400 mg,每日2次)新辅助疗法进行为期4周的治疗后,肿瘤部位出现了显著的111In-贝伐单抗摄取减少。这种减少与肿瘤血管的破坏相对应,与VEGF表达无关。

      以上研究证实这些显像探针可应用于临床诊断和个体化用药中的疗效监测,同时说明,在预测贝伐单抗治疗效果方面,显像比测量VEGF的表达水平效果更好。尽管这些研究都不能证实抗血管生成治疗后特异性显像剂的摄取降低完全是由靶向受体表达水平降低导致的,但在治疗中和治疗后使用核素分子靶向显像仍然是必要并且有价值的,其放射性示踪剂的摄取水平仍然与抗血管生成疗法的有效性相对应。

    • 整合素是细胞黏附分子家族的重要成员之一,主要介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质(extra cellular matrix,ECM)之间的相互黏附,并介导细胞与ECM之间的双向信号传导,它由α亚单位和β亚单位组成,可组合形成24种不同的整合素受体。在血管生成早期,整合素αvβ3在激活的内皮细胞上高表达,参与肿瘤的血管生成、侵袭转移等病理过程。因此,整合素αvβ3成为许多抗肿瘤血管生成药物的靶点[2]。含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)序列的多肽可被整合素αvβ3受体识别,放射性核素标记的含RGD序列的多肽作为肿瘤血管生成的显像剂和治疗药物的研究已成为热点。研究已证实一些肿瘤细胞,如恶性胶质瘤、黑色素瘤和乳腺癌等肿瘤细胞均有整合素αvβ3的高表达,整合素αvβ3已被证明是血管生成显像适合的分子靶点[15]。随着以整合素αvβ3为靶点的化学疗法的进展,对整合素αvβ3表达的无创性分子显像变得重要,它可以提供肿瘤对这些抗血管生成药物的治疗反应的可视化信息。

      RGD环肽c-末端氨基酸相连乙二醇链(99Tcm -cyclic RGD peptide,99Tcm-NC100692)是临床上已有研究的整合素αvβ3 SPECT显像剂。99Tcm-NC100692显示出对整合素αvβ3(IC50 = 1 nmol/L)的高亲和性,对乳腺癌患者5~40 mm的恶性病变有良好的检出率(19/22)[16]。在对乳腺癌和肺癌患者进一步的研究中,99Tcm -NC100692 对脑转移(1/1)和肺转移(4/5)均显示出高灵敏度,但对肝转移(1/7)和骨转移(8/17)的灵敏度不高[17],不足的是,99Tcm-NC100692含RGD环五肽,所以在肝脏中高摄取,并经肾脏排泄。岳宁等[18]将RGD多肽糖基化以提高其亲水性并改善药代动力学特征,从而对肾通路的排泄途径进行重新定向。体内研究显示,糖基化的RGD比放射性标记的非糖基化多肽类的肝摄取减少,血中浓度增大,并且增加了其在肿瘤中的摄取和滞留。

      Avastin是一种人源化单克隆免疫球蛋白G抗体,可阻止VEGF与其受体在血管内皮表面结合,抑制血管内皮增生和新生血管形成。邵国强等[19]使用99Tcm-聚乙二醇-RGD环状二聚体SPECT显像评价抗血管生成药物Avastin治疗肿瘤的疗效。在荷人脑胶质瘤(U87MG)和荷人前列腺癌(PC-3)裸鼠模型中,给予裸鼠Avastin腹腔注射,每日50 mg/kg,隔日1次,共计8次/只,Avastin治疗3 d后,治疗组肿瘤部位99Tcm-聚乙二醇-RGD环状二聚体的摄取(%ID/g)明显低于对照组肿瘤部位的摄取(t=3.26,P < 0.05),且随着治疗进行,治疗组肿瘤的放射性摄取(%ID和%ID/g)均逐渐减少。研究证实,治疗中肿瘤部位放射性摄取的变化明显早于肿瘤体积的变化。因此在抗血管生成治疗早期的疗效评价上,99Tcm-聚乙二醇-RGD环状二聚体SPECT显像显示出了明显优势,其动态监测可为早期评价肿瘤抗血管生成的疗效提供数据支持。

      2005年,18F-低聚半乳糖-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(18F-Galacto-Arg-Gly-Asp,18F-Galacto-RGD)在转移性黑素瘤、软骨肉瘤、转移性肾癌和绒毛结节性滑膜炎患者中得到评估[20]。一项18F-Galacto-RGD和18F-FDG 显像的对比研究结果证实,18F-Galacto-RGD与18F-FDG的肿瘤摄取不相关。研究人员认为,尽管18F-FDG对肿瘤分期更加敏感,但18F-Galacto-RGD是对计划和评估抗血管生成治疗反应最好的显像方法[21]。另一种很有前景的整合素αvβ3显像剂18F-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽(18F-AH111585 Arg-Gly-Asp peptide,18F-fluciclatide)的合成比18F-Galacto-RGD更具有可行性,它是一种RGD肽,并且已通过环化改善了药代动力学特征,引入多种二硫键并与一种聚乙二醇间隔段进行结合,将体内降解减小到最少。18F-fluciclatide成功实现了对转移性乳腺癌患者18个肿瘤病灶的显像[22]。使用18F-fluciclatide对胶质母细胞瘤异种移植的荷瘤小鼠进行体内研究显示,18F-fluciclatide能够对舒尼替尼治疗后的早期抗血管生成反应进行显像[23],再次提示了这一示踪剂的临床前景。

      与前面所述的RGD肽单聚体示踪剂比较,多聚体RGD具有更好的体内特性。当RGD肽二聚体通过螯合剂1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸和HYNIC用99Tcm进行放射性标记时,其保留了对整合素αvβ3的高亲和性(IC50 = 0.9 nmol/L)。Janssen等[24]在卵巢癌裸鼠模型中将99Tcm-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸环肽二聚体肽二聚体的肿瘤靶向性与99Tcm-联肼尼克酰胺-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸环肽二聚体肽单聚体进行对比,结果显示,二聚体对整合素αvβ3的亲和性(IC50 =0.1 nmol/L)比单聚体(IC50 = 1.0 nmol/L)高10倍,而且在1 h后二聚体的肿瘤中摄取更高,结果表明RGD肽二聚体优于单聚体。Liu[25]在人肾细胞癌异种移植模型中对c(RGDfK)肽的RGD单聚体、二聚体和四聚体进行了对比显像研究,结果证实,增加多价肽可提高其与整合素αvβ3的亲和性。RGD多聚体的非肿瘤器官,如肺、脾和肠的摄取也呈现特异性增加,提示整合素αvβ3也会在正常组织中表达,较高的肾和肠摄取会阻碍四聚体示踪剂对这些器官附近的肿瘤进行显像。

    • 纤连蛋白存在多种亚型,其中含有纤连蛋白 ED-B 的亚型在血管增生中发挥主要作用,同时它在胚胎和肿瘤组织中高度表达,但在正常成人组织中的表达非常有限。

      为了成功获取纤连蛋白 ED-B的成像途径,Wang等[26]用噬菌体展示技术合成ED-B的单链抗体scFv(single chain variable fragment,单链抗体基因片段),将123I-ED-B的单链抗体片段二聚体在肺癌、结肠癌和脑肿瘤患者中显像,结果表明其是一种无临床不良反应、适用于肿瘤血管生成的显像剂。Berndorff等[27]将氨基酸序列(Gly)3-Cys-Ala插入羧基端创造出可以用99Tcm进行放射性标记的AP39。这种放射性示踪剂保留了较高的免疫反应性,在畸胎瘤异种移植瘤动物模型中有较高的T/NT比值,注射后3 h肿瘤摄取最多。纤连蛋白ED-B的成像示踪剂有用于肿瘤血管生成显像并应用于临床的可能性。

    • 由于MMP能够降解ECM蛋白质,包括基膜,因此其在血管生成中起关键作用。MMP有不同种类,但只有MMP-2和MMP-9与恶性肿瘤组织相关,并且通过ECM释放的生长因子(如VEGF)参与血管生成[1]。目前很多基于MMP抑制剂抗体的治疗策略均在进行评估。

      最新研究合成的MMP抑制剂马马司他被用做一种新型的PET显像示踪剂18F-马马司他-(4-叔丁基苯基)三氟硼酸钾。18F-马马司他-(4-叔丁基苯基)三氟硼酸钾可以停留在MMP-2表达的移植瘤上且不影响MMP-2的抑制效率,但由于其T/NT比值过低,因此需要对该示踪剂进行进一步的优化才能有新的发展[28]

    • 研究人员不断研究抗血管生成新药并测试其应用前景,同时也在探索目前已批准药物的新的治疗用途。抗血管生成药物作用机制包括:①通过阻断肿瘤血管扩张生长并使已形成的肿瘤血管消退,从而阻断营养素和氧的供给,使细胞增殖终止,肿瘤大小被控制。但是,肿瘤血管减少的同时也会产生另一个结果,即瘤体内部区域缺氧,导致肿瘤对放、化疗产生耐药性并增加转移的可能性;②抗血管生成药物也可通过使肿瘤血管正常化,增加治疗药物的可及性和放疗效果而达到治疗目的[29]。用于抗血管生成疗法的药物很多,但关于个体化抗血管生成疗法如何作用以及这些药物耐药性产生的机制一直不明确,而且不同剂量的抗血管生成药物的作用机制也不同,因此,依据血管正常化、低氧和转移可能性的权重来调整个体化治疗方案显得更为重要[2]。为了研究不同的血管生成靶向药物的作用方式以及不同剂量的治疗效果,迫切需要发现一种靶向肿瘤血管生成的特异性标志物。

      个体化用药旨在区分不同个体对特定的抗血管生成疗法的敏感性和不良反应的差异。对关键的血管生成分子靶点进行核素显像在抗血管生成个体化用药中起关键作用。这一技术在筛选抗血管生成药物的治疗对象以及对接受治疗的患者进行分层并监测治疗反应方面有很大潜能,同时核素显像对于确定是否已出现耐药性也有帮助,此外,它在研究抗血管生成药物的耐药机制中也发挥作用。

      以VEGF、VEGFR和整合素ανβ3等作为靶点的放射性标记分子探针都经过深入研究并被证明可以成为血管生成的分子标志物。但是一些基于VEGF的探针都有一个缺点,即它们不仅把VEGFR2当做靶点,同时也会把诱骗受体VEGFR1当做靶点,导致这些探针并不能对肿瘤内的VEGF信号进行准确描述。大部分基于RGD的探针中也发现上述问题,即基于RGD的探针也会把其他正常组织中的整合素ανβ3当做靶点,造成肝脏对显像剂的高摄取,从而使其对肝脏附近肿瘤的灵敏度降低。此外,与标准成像技术相比,上述探针的制备存在着放射性标记方法复杂、显像本底值高和灵敏度低等缺点,还需要大量的优化措施进行不断改进。由于针对血管生成靶点的探针的合成方法复杂,因此虽然目前已经合成了多个探针,但还没有一个在临床上常规使用。

      111In-贝伐单抗、89Zr-雷珠单抗和18F-fluciclatide探针分别在动物模型或临床上对抗肿瘤血管生成治疗的疗效进行了显像监测,从而证实这些探针对索拉菲尼、贝伐单抗和舒尼替尼治疗肿瘤的反应进行成像监测具有可行性[11, 13, 23]

      随着新型基于整合素ανβ3的抗血管生成药物的发展,放射性核素标记RGD肽的探针很可能会随着肿瘤抗血管生成疗法的个体化而变得更加受到关注。因此,如果进一步的临床试验证明基于RGD的放射性核素显像探针同样具有潜力,那么无论其作为单一治疗还是与其他抗血管生成药物或细胞毒性药物联合治疗,基于整合素ανβ3的疗法都是个体化抗血管生成疗法的一种可行的途径[30]

      如何简化这些探针的标记合成过程、提高其灵敏度及特异度、减少显像中的高本底值,还需要我们进行大量的试验进行优化和改进。

    • 尽管抑制肿瘤生长的血管生成靶向疗法的理想途径尚未建立,但可以肯定的是放射性核素显像方法将是实现个体化抗血管生成疗法的关键。以血管生成为靶点的放射性核素标记探针将在实现治疗前和治疗期间的患者分层以及确定抗血管生成疗法的耐药机制方面发挥核心作用,最终实现更加灵活的个性化治疗。

参考文献 (30)

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