靶向TSPO显像剂99Tcm-DTPA-CB86的制备及其对关节炎症的SPECT/CT显像研究

刘鹏 董文涛 苏新辉 黄剑全 王亮亮 蒋怡臻 郭志德 马超 苏福

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靶向TSPO显像剂99Tcm-DTPA-CB86的制备及其对关节炎症的SPECT/CT显像研究

    通讯作者: 苏新辉, suxinhuii@163.com
  • 基金项目:

    福建省自然科学基金 2015J01519

    厦门市科技项目 2015S0288

    人社部留学人员科技活动项目择优资助 2014-240

    国家自然科学基金面上项目 81571707

    教育部留学回国人员科研启动基金 2014-1685

    福建省卫计委青年科研课题 2015-2-46

    福建省卫生系统中青年骨干人才培养项目 2014-ZQN-ZD-35

Preparation and imaging of arthritis of 99Tcm-DTPA-CB86 for TSPO targeted imaging

    Corresponding author: Xinhui Su, suxinhuii@163.com ;
  • Fund Project: Natural Science Foundation of Fujian Province 2015J01519Science and Technology Project for Xiamen 2015S0288Technology Foundation for Selected Overseas Chinese Scholar, Ministry of Human Resources and Social Security of China 2014-240National Natural Science Foundation of China 81571707Scientific Research Foundation for the Returned Overseas Chinese Scholars, Ministry of Education of China 2014-1685Program for Young Scholars of Fujian Health and Family Planning Commission 2015-2-46Program for Training Young Talents of Fujian Health 2014-ZQN-ZD-35

  • 摘要: 目的制备99Tcm标记的转运蛋白(TSPO)配体CB86[99Tcm-DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)-CB86],探讨其作为TSPO靶向关节炎症显像新型分子探针的可行性。方法通过偶联双功能螯合剂制备DTPA-CB86,进行99Tcm标记,经高效液相色谱纯化,测定其放化纯度和体外稳定性。选用巨噬细胞RAW264.7进行体外细胞结合实验,测定99Tcm-DTPA-CB86的结合率和外排率。采用弗氏佐剂建立左踝关节炎症小鼠模型,对其行99Tcm-DTPA-CB86 Micro SPECT/CT显像,并观察探针的体内分布情况。采用SPSS 18.0统计软件对符合正态分布及方差齐性的数据进行t检验。结果99Tcm-DTPA-CB86的标记率为(95.86 ±2.45)%,放化纯度为(97.45 ±0.69)%,其在室温下的磷酸盐缓冲液中的稳定性良好,放置4 h后,其标记率仍>90%。99Tcm-DTPA-CB86能与巨噬细胞RAW264.7特异性结合,3 h的摄取率达到最高峰[(36.45 ±2.18)%],在加入过量未标记的DTPA-CB86后,RAW264.7细胞对99Tcm-DTPA-CB86的摄取明显受到抑制[(10.43 ±2.01)%],与未阻断时相比差异具有统计学意义(t=6.217,P < 0.05);RAW264.7细胞对99Tcm-DTPA-CB86外排较少,摄取率从4.5 h时的(33.31 ±2.34)%到8 h时的(19.32 ±2.01)%,减少了13.99%。Micro SPECT/CT显像结果显示,99Tcm-DTPA-CB86在小鼠左踝关节炎症部位清晰可见,且能被过量的DTPA-CB86明显抑制;体内生物学分布结果表明,其具有较好的炎症靶向性;注射后3 h踝关节炎症部位的摄取仍可达(2.35 ±0.10)% ID/g。结论99Tcm标记CB86易于制备,具有较好的理化性质及体内代谢学性质,同时具有较好的关节炎症摄取,有望发展成新的TSPO靶向SPECT关节炎症显像分子探针。
  • 图 1  RAW264.7巨噬细胞对99Tcm-DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)-CB86的摄取曲线(n=3)

    Figure 1.  In vitro uptake of 99Tcm-DTPA-CB86 in RAW264.7 cells (n=3)

    图 2  RAW264.7巨噬细胞对99Tcm-DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)-CB86的摄取曲线(n=3)

    Figure 2.  In vitro uptake of 99Tcm-DTPA-CB86 in RAW264.7 cells (n=3)

    图 3  未阻断组左踝关节炎症小鼠注射99Tcm-DTPA-CB86后不同时间的Micro SPECT/CT显像图(方框示左踝关节炎症)

    Figure 3.  Micro SPECT/CT imaging of 99Tcm-DTPA-CB86 in mice models of arthritis in the unblocked group at various times after injection (box showing left arthritis)

    图 4  竞争性抑制组左踝关节炎症小鼠注射99Tcm-DTPA-CB86后不同时间的Micro SPECT/CT显像图(方框示左踝关节炎症)

    Figure 4.  Micro SPECT/CT imaging of 99Tcm-DTPA-CB86 in mice models of arthritis in the blocked group at various times after injection (box showing left arthritis)

    表 1  99Tcm-DTPA-CB86在左踝关节炎症小鼠体内的生物学分布[x± s(%ID/g)](n= 4)

    Table 1.  Biodistribution for 99Tcm-DTPA-CB86 in mice models of arthritis[x± s %ID/g)] (n = 4 for each group)

    组织或器官注射后时间/h
    0.51.53
    1.49±0.170.46±0.060.33±0.05
    5.56±0.763.82±0.972.14±0.23
    1.51±0.141.80±0.330.68±0.16
    2.03±0.251.86±0.381.71±0.28
    1.24±0.430.91±0.080.58±0.03
    2.76±0.361.77±0.311.34±0.21
    0.51±0.160.49±0.090.41±0.07
    肌肉1.01±0.121.47±0.120.78±0.02
    小肠3.48±0.592.83±0.631.97±0.28
    血液0.78±0.070.68±0.080.56±0.09
    左踝关节炎症部位1.33±0.162.01±0.182.35±0.10
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  • [1] Fan J, Lindemann P, Feuilloley MG, et al. Structural and functional evolution of the translocator protein(18 kDa)[J]. Curr Mol Med, 2012, 12(4):369-386. DOI:10.2174/1566524011207040369.
    [2] Crawshaw AA, Robertson NP. The role of TSPO PET in assessing neuroinflammation[J]. J Neurol, 2017, 264(8):1825-1827. DOI:10.1007/s00415-017-8565-1.
    [3] Narayan N, Mandhair H, Smyth E, et al. The macrophage marker translocator protein(TSPO) is down-regulated on pro-inflammatory 'M1' human macrophages[J/OL]. PLoS One, 2017, 12(10): e0185767[2017-11-19]. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmid/28968465. DOI: 10.1371/journal.pone.0185767.eCollection2017.
    [4] Shao X, Wang X, English SJ, et al. Imaging of carrageenan-induced local inflammation and adjuvant-induced systemic arthritis with[11C]PBR28PET[J]. Nucl Med Biol, 2013, 40(7):906-911. DOI:10.1016/j.nucmedbio.2013. 06.008.
    [5] Dupont AC, Largeau B, Santiago Ribeiro MJ, et al. Translocator protein-18 kDa (TSPO) positron emission tomography (PET) imaging and its clinical impact in neurodegenerative diseases[J/OL]. Int J Mol Sci, 2017, 18(4): E785[2017-11-19]. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmid/28387722. DOI: 10.3390/ijms18040785.
    [6] Wen M, Qu CR, Su XH, et al. A practical process for the synthesis of translocator protein 18 kDa imidazopyridine ligand[J]. Wuhan Univ J Nat Sci, 2014, 19(1):19-26. DOI:10.1007/s11859-014-0973-9.
    [7] Su X, Cheng K, Liu Y, et al. PET imaging of insulin-like growth factor type 1 receptor expression with a 64Cu-labeled Affibody molecule[J]. Amino Acids, 2015, 47(7):1409-1419. DOI:10.1007/s00726-015-1975-4.
    [8] Su X, Cheng K, Jeon J, et al. Comparison of two site-specifically 18F-labeled affibodies for PET imaging of EGFR positive tumors[J]. Mol Pharm, 2014, 11(11):3947-3956. DOI:10.1021/mp5003043.
    [9] 豆晓锋, 张亚飞, 蒋怡臻, 等. 131I标记抗NRP-1单克隆抗体A6在荷瘤裸鼠体内分布和显像研究[J].中华核医学与分子影像杂志, 2014, 34(6):495-499. DOI:10.3760/cma.j.issn.2095-2848. 2014.06.017.
    Dou XF, Zhang YF, Jiang YZ, et al. Biodistribution and imaging of 131I labeled anti-neuropilin-1 monoclonal antibody in malignant gliomas xenografts[J]. Chin J Nucl Med Mol Imaging, 2014, 34(6):495-499. doi: 10.3760/cma.j.issn.2095-2848.2014.06.017
    [10] Neyt S, Vliegen M, Verreet B, et al. Synthesis, in vitro and in vivo small-animal SPECT evaluation of novel technetium labeled bile acid analogues to study(altered) hepatic transporter function[J]. Nucl Med Biol, 2016, 43(10):642-649. DOI:10.1016/j.nucmedbio.2016. 07.001.
    [11] Chang Y, Wu Y, Wang D, et al. Therapeutic effects of TACI-Ig on rats with adjuvant-induced arthritis via attenuating inflammstory responses[J]. Rheumatology(Oxford), 2011, 50(5):862-870. DOI:10.1093/rheumatology/keq404.
    [12] Laquintana V, Denora N, Musacchio T, et al. Peripheral benzodiazepine receptor ligand-PLGA polymer conjugates potentially useful as delivery systems of apoptotic agents[J]. J Control Release, 2009, 137(3):185-195. DOI:10.1016/j.jconrel.2009. 04.007.
    [13] Musacchio T, Laquintana V, Latrofa A, et al. PEG-PE micelles loaded with paclitaxel and surface-modified by a PBR-ligand:synergistic anticancer effect[J]. Mol Pharm, 2009, 6(2):468-479. DOI:10.1021/mp800158c.
    [14] 张伟, 蔡亮, 陈跃, 等.双功能制剂99Tcm-Gd-DTPA-DG的制备及在荷瘤裸鼠体内的生物分布[J].中华核医学杂志, 2011, 31(2):117-120. DOI:10.3760/cma.j.issn.0253-9780. 2011.02.011.
    Zhang W, Cai L, Chen Y, et al. Synthesis and biodistribution of a bi-functional agent 99Tcm-Gd-DTPA-DG in tumor bearing nude mice[J]. Chin J Nucl Med, 2011, 31(2):117-120. doi: 10.3760/cma.j.issn.0253-9780.2011.02.011
  • [1] 秦丽军李万婷武志芳陆克义刘建中胡光李思进刘海燕99Tcm-MDP SPECT/CT骨显像在绝经后女性骨质疏松性胸腰椎椎体骨折中的增益价值. 国际放射医学核医学杂志, 2017, 41(3): 173-177. doi: 10.3760/cma.j.issn.1673-4114.2017.03.003
    [2] 孔维静徐颖 . 综合干预措施下评估首次131I清甲治疗对分化型甲状腺癌患者唾液腺的慢性损伤. 国际放射医学核医学杂志, 2018, 42(1): 30-35. doi: 10.3760/cma.j.issn.1673-4114.2018.01.006
    [3] 洪智慧周小林石怡珍刘增礼131I标记抗胃泌素释放前体单链抗体的制备及其稳定性和免疫活性研究. 国际放射医学核医学杂志, 2010, 34(2): 107-109. doi: 10.3760/cma.j.issn.1673-4114.2010.02.013
    [4] 刘彧 . 放射性核素在关节炎治疗中的应用. 国际放射医学核医学杂志, 2003, 27(2): 59-62.
    [5] 郝林军王雪梅郝晋99Tcm-RGD显像在类风湿性关节炎血管形成早期诊断的初步探讨. 国际放射医学核医学杂志, 2015, 39(2): 184-187. doi: 10.3760/cma.i.issn.1673-4114.2015.02.018
    [6] 陈鹏宋长祥陆武刘永袁小帅杜鹏 . SPECT同机定位CT引导经皮肺穿刺活检术联合肿瘤标志物检测对周围型肺癌的诊断价值. 国际放射医学核医学杂志, 2018, 42(1): 21-24, 29. doi: 10.3760/cma.j.issn.1673-4114.2018.01.004
    [7] 宋其韬龙雷 . SPECT/CT对全髋关节置换术后并发症的诊断价值. 国际放射医学核医学杂志, 2017, 41(3): 199-204. doi: 10.3760/cma.j.issn.1673-4114.2017.03.008
    [8] 胡伟赵军 . 小胶质细胞在AD炎性机制中的作用及其常见PET显像剂的应用进展. 国际放射医学核医学杂志, 2016, 40(1): 44-49. doi: 10.3760/cma.j.issn.1673-4114.2016.01.009
    [9] 邹珍常娅妮崔雅丽晋建华 . 巨大甲状旁腺腺瘤99Tcm-MIBI双时相SPECT/CT显像一例. 国际放射医学核医学杂志, 2017, 41(2): 156-158. doi: 10.3760/cma.j.issn.1673-4114.2017.02.014
    [10] 米彦霞郭晋纲王莉莉杨淑英任媛 . SPECT/CT融合显像在腰椎横突骨折诊断中的应用价值. 国际放射医学核医学杂志, 2017, 41(5): 321-324. doi: 10.3760/cma.j.issn.1673-4114.2017.05.003
    [11] 夏伟吕中伟王国玉侯仁花蔡海东袁雪宇99Tcm标记depreotide及与肺腺癌A549细胞亲和性研究. 国际放射医学核医学杂志, 2010, 34(4): 193-197. doi: 10.3760/cma.j.issn.1673-4114.2010.04.001
    [12] 范光磊吴翼伟章斌 . 用99mTc标记胰岛素样生长因子1类似物的方法学研究. 国际放射医学核医学杂志, 2007, 31(4): 208-211.
    [13] 李楠李培勇 . 放射性碘间接标记抗体方法的研究进展. 国际放射医学核医学杂志, 2008, 32(5): 260-263.
    [14] 朱沭赵明陈璟 . 核酸及其类似物的常见放射性核素标记及显像. 国际放射医学核医学杂志, 2011, 35(1): 44-48. doi: 10.3760/cma.j.issn.1673-4114.2011.01.013
    [15] 赵惠扬 . 放射性核素计算机处理断层摄影术. 国际放射医学核医学杂志, 1979, 3(1): 36-41.
    [16] 刘淑蓉陈国强郑亮张玉珍韩瑞娟赵瑞平杨旗李坤成孙凯吕滨 . CT心脑血管一体化成像的图像质量评价. 国际放射医学核医学杂志, 2018, 42(5): 389-396. doi: 10.3760/cma.j.issn.1673-4114.2018.05.001
    [17] 周益勤张万亨 . X线和放射性同位素检查对儿童的辐射剂量. 国际放射医学核医学杂志, 1980, 4(1): 72-73.
    [18] 南楠朱小华 . 分化型甲状腺癌131I显像假阳性的原因分析. 国际放射医学核医学杂志, 2018, 42(1): 62-68. doi: 10.3760/cma.j.issn.1673-4114.2018.01.012
    [19] 马藤轩昂张杰付畅孙萌萌尤阳徐俊玲 . 2型糖尿病患者大脑静息葡萄糖代谢改变研究. 国际放射医学核医学杂志, 2018, 42(1): 25-29. doi: 10.3760/cma.j.issn.1673-4114.2018.01.005
    [20] 戴云秀杨光杰王振光赵钰鋆于明明李大成武凤玉刘思敏18F-FDG PET/CT基线SUVmax在滤泡性淋巴瘤侵袭性、分期评价中的价值及其与中期疗效的相关性研究. 国际放射医学核医学杂志, 2018, 42(2): 104-110. doi: 10.3760/cma.j.issn.1673-4114.2018.02.002
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出版历程
  • 收稿日期:  2017-11-19
  • 刊出日期:  2018-01-25

靶向TSPO显像剂99Tcm-DTPA-CB86的制备及其对关节炎症的SPECT/CT显像研究

    通讯作者: 苏新辉, suxinhuii@163.com
  • 1. 361004, 厦门大学附属中山医院核医学科
  • 2. 366000, 福建省三明市第二医院核医学科
  • 3. 361102, 厦门大学分子影像暨转化医学研究中心
  • 4. 350001 福州, 福建医科大学附属协和临床医学院
基金项目:  福建省自然科学基金 2015J01519厦门市科技项目 2015S0288人社部留学人员科技活动项目择优资助 2014-240国家自然科学基金面上项目 81571707教育部留学回国人员科研启动基金 2014-1685福建省卫计委青年科研课题 2015-2-46福建省卫生系统中青年骨干人才培养项目 2014-ZQN-ZD-35

摘要: 目的制备99Tcm标记的转运蛋白(TSPO)配体CB86[99Tcm-DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)-CB86],探讨其作为TSPO靶向关节炎症显像新型分子探针的可行性。方法通过偶联双功能螯合剂制备DTPA-CB86,进行99Tcm标记,经高效液相色谱纯化,测定其放化纯度和体外稳定性。选用巨噬细胞RAW264.7进行体外细胞结合实验,测定99Tcm-DTPA-CB86的结合率和外排率。采用弗氏佐剂建立左踝关节炎症小鼠模型,对其行99Tcm-DTPA-CB86 Micro SPECT/CT显像,并观察探针的体内分布情况。采用SPSS 18.0统计软件对符合正态分布及方差齐性的数据进行t检验。结果99Tcm-DTPA-CB86的标记率为(95.86 ±2.45)%,放化纯度为(97.45 ±0.69)%,其在室温下的磷酸盐缓冲液中的稳定性良好,放置4 h后,其标记率仍>90%。99Tcm-DTPA-CB86能与巨噬细胞RAW264.7特异性结合,3 h的摄取率达到最高峰[(36.45 ±2.18)%],在加入过量未标记的DTPA-CB86后,RAW264.7细胞对99Tcm-DTPA-CB86的摄取明显受到抑制[(10.43 ±2.01)%],与未阻断时相比差异具有统计学意义(t=6.217,P < 0.05);RAW264.7细胞对99Tcm-DTPA-CB86外排较少,摄取率从4.5 h时的(33.31 ±2.34)%到8 h时的(19.32 ±2.01)%,减少了13.99%。Micro SPECT/CT显像结果显示,99Tcm-DTPA-CB86在小鼠左踝关节炎症部位清晰可见,且能被过量的DTPA-CB86明显抑制;体内生物学分布结果表明,其具有较好的炎症靶向性;注射后3 h踝关节炎症部位的摄取仍可达(2.35 ±0.10)% ID/g。结论99Tcm标记CB86易于制备,具有较好的理化性质及体内代谢学性质,同时具有较好的关节炎症摄取,有望发展成新的TSPO靶向SPECT关节炎症显像分子探针。

English Abstract

  • 位于线粒体外膜的相对分子质量为18 000的转运蛋白(translocator protein, TSPO),曾被称为外周的苯二氮卓类受体(peripheral benzodiazepine receptor, PBR),是在进化上具有高度保守性的转运蛋白家族成员之一,主要位于肾上腺、睾丸、卵巢等细胞的线粒体外膜上,介导类固醇的合成[1]。在中枢神经系统炎症中,TSPO高表达于激活的小胶质细胞和星形胶质细胞[2]。近年的研究结果显示,在外周组织炎症中,TSPO也高表达于巨噬细胞和单核细胞[3-4],这表明TSPO可作为参与炎症反应的免疫细胞显像的靶点。目前,在TSPO显像中主要是用11C或18F标记TSPO配体行PET显像,如11C-(R)-PK11195、11C-PBR28、11C-DAA1106、18F-FEPPA、18F-PBR06和18F-DPA-714等[5],且有些已进入临床应用。与发射正电子的放射性核素11C和18F相比,发射单光子的放射性核素99Tcm具有价格较低廉,来源、运输方便,半衰期长,操作方便,使用范围较广等优点,且SPECT较PET便宜、普及,因此,研发新型99Tcm标记的TSPO靶向的分子探针具有较重要的临床价值。本研究以具有与TSPO较高亲合力的新型配体CB86[6]为母体,借助其表面的氨基偶联双功能螯合剂DTPA获得DTPA-CB86,进行99Tcm标记后获得新型探针99Tcm-DTPA-CB86,行左踝关节炎症小鼠Micro SPECT/CT显像,并研究其在体内的分布情况,现报道如下。

    • 99Mo/99Tcm发生器购自北京原子高科股份有限公司;CB86由苏新辉课题组与武汉大学药学院洪学传课题组合作制备,并已纯化、鉴定[6];DTPA购自生工生物工程(上海)股份有限公司;CRC-25R型放射性核素活度计为美国CAPINTEC公司产品;WIZARD 2480型γ计数仪为美国珀金埃尔默仪器公司产品;Dionex Ulti-Mate 3000型高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)仪为美国Thermo Scientific公司产品;FM-2000型锝分析仪为北京东方圆通科技发展有限公司产品;Sep-Pak C18 Plus固相萃取柱(简称C18色谱柱)为美国Waters公司产品;nanoScan型SPECT/CT仪为匈牙利Mediso Medical Imaging System公司产品;DMEM培养基购自美国Gibco BRL公司;胎牛血清购自美国Gemini公司;小鼠巨噬细胞RAW264.7由厦门大学生命科学学院俞春东课题组赠送;BALB/c小鼠由厦门大学实验动物中心提供(4~5周龄,雌性,体重18~20 g)。其余试剂均为国产分析纯。

    • 向溶解有50 mg CB86的二甲基亚砜溶液中加入200 mg DTPA,在20℃下于转速为1200 r/min的磁力加热搅拌器上避光反应30 h,用C18柱纯化,得到DTPA-CB86。取1 mL高锝酸钠洗脱液(约370 MBq)加入200 μL DTPA-CB86中,再加入20 μL新鲜配制的SnCl2,置于振荡模块上100℃避光反应约30 min,冷却至室温。取出反应液,以生理盐水为展开剂,用HPLC测定标记产物的标记率。将上述反应液通过C18柱,以2 mL PBS(pH值7.4)为淋洗液进行纯化,将纯化后的反应液用上述同样的方法测定标记产物的放化纯度。取100 μL纯化后的反应液99Tcm-DTPA-CB86置于1 mL PBS中,室温放置,分别在1、2、4 h后取出反应液,用上述同样的方法测定99Tcm-DTPA-CB86的稳定性。

    • 按文献报道方法,在37℃、5% CO2培养箱中常规培养RAW264.7细胞[7-9]。待细胞生长至对数生长期,用0.25%胰酶消化,将RAW264.7细胞悬液铺于24孔板中(2×105个/孔),于37℃、5% CO2培养箱中培养过夜并分成两组,一组为未抑制组,另一组为抑制组,每组设3个复孔。先将99Tcm-DTPA-CB86用无血清的DMEM培养基稀释成1.11×10-1 MBq/mL。在未抑制组中加入100 μL 1.11 × 10-2 MBq 99Tcm-DTPA-CB86;在抑制组中同时加入100 μL 1.11×10-2 MBq 99Tcm-DTPA-CB86和10 μg未标记的DTPA-CB86,上述各孔用无血清培养基补充总体积至1 mL。将两组放置在37℃、5%CO2培养箱中培养,温育的时间点均为0.5、2、3和4 h。将孔板中所有的培养基完全吸出,然后加入0.5 mL冰冷的PBS洗2次,向所有孔板中加入1 mL 1 mol/L NaOH,室温下放置5~10 min。然后,用细胞刮刀轻刮孔板底部,使细胞完全脱离,吸取孔板内所有溶液和细胞,放入离心管中,用γ计数仪测定细胞的放射性计数(即反应管)以及总T管和空白管的放射性计数(各3支)。细胞摄取率= [(反应管计数-空白管计数)/总T管计数]×100%,绘制出细胞摄取曲线。

    • 细胞按文献[10]报道方法培养,将细胞悬液铺于24孔板中(2×105个/孔),每孔加入100 μL 1.11×10-2 MBq 99Tcm-DTPA-CB86共同培养,放入37℃、5%CO2培养箱中培养4.5、5.5、7和8 h。在每个时间点上,将孔内的细胞培养基吸走丢弃,用冷的PBS冲洗细胞2次,再加入1 mL 1 mol/L NaOH裂解细胞,收集于离心管内。将收集有细胞裂解液的离心管在γ计数仪上测定细胞的放射性计数(即反应管)以及总T管和空白管的放射性计数(各3支)。细胞摄取率=[(反应管计数-空白管计数)/总T管计数]×100%,绘制出细胞摄取曲线,间接反映99Tcm-DTPA-CB86从细胞的释放情况。

    • 取体重为18~20 g的BALB/c雌鼠,按文献报道方法于左下足跖皮内注射100 μL弗氏佐剂,4周时左踝关节出现炎症肿胀,视为造模成功,即可备用[11]。采用直接抽样方法选取体重相近、左踝关节中度红肿的模型鼠12只,分为3组,每组4只,经尾静脉注射100 μL、0.37 MBq 99Tcm-DTPA-CB86,并于注射后不同时间点(0.5、1.5和3 h)处死裸鼠,取心、肝、脾、肺、肾、骨、肌肉、胃、肠和左踝关节炎症组织等主要脏器及组织,测量其质量及放射性计数,经参考源校正后计算每克组织百分注射剂量率(%ID/g),以及左踝关节炎症组织与血液(arthritic ankle to blood,A/B)、左踝关节炎症组织与正常肌肉(arthritic ankle to muscle,A/M)的放射性比值。

    • 采用直接抽样方法选取体重相近、左踝关节中度红肿的模型小鼠6只,分为未阻断组和竞争性抑制组,每组3只。未阻断组小鼠经尾静脉注射100 μL 3.7 MBq 99Tcm-DTPA-CB86;竞争性抑制组小鼠经尾静脉注射100 μL 3.7 MBq 99Tcm-DTPA-CB86和300 μg未标记的DTPA-CB86。两组小鼠均用5%的水合氯醛经腹腔麻醉,俯卧位固定于鼠板上,分别于注射0.5、1.5和3 h时行Micro SPECT/CT显像,使用平行孔准直器,将小鼠放置于视野中心,进行Micro SPECT断层扫描成像。然后进行CT扫描,通过电脑重建后得到短轴、水平长轴及垂直长轴的小鼠SPECT/CT融合图像。

    • 采用SPSS 18.0软件进行统计学分析,所得数据均以均数±标准差(x± s)表示。采用Kolmogorov-Smirnov test(柯尔莫诺夫-斯米尔诺夫检验)分析数据是否符合正态分布(P > 0.1为符合正态分布标准),用Levene检验分析数据是否符合方差齐性(sig >0.05为符合方差齐性),对符合正态性分布及方差齐性的数据采用t检验,P < 0.05表示差异有统计学意义。

    • 经HPLC分析99Tcm-DTPA-CB86具有较高的标记率[(95.86 ±2.45)%]和放化纯度[(97.45 ± 0.69)%]。稳定性实验结果显示,99Tcm-DTPA-CB86在室温下的PBS溶液中稳定性良好,放置4 h后其标记率仍>90%。

    • 细胞摄取实验结果如图 1所示,小鼠RAW264.7巨噬细胞对99Tcm-DTPA-CB86的摄取率在0.5 h为(28.45 ± 1.56)%,3 h时达到最高峰[(36.45 ± 2.18)%],4 h时摄取率虽然有所下降,仍保持在较高水平[(35.63 ± 2.21)%]。在加入过量未标记的DTPA-CB86时,RAW264.7细胞对99Tcm-DTPA-CB86的摄取明显下降,且随时间的延长而逐渐下降,与未阻断组相比,细胞摄取下降差异具有统计学意义(t=6.217,P < 0.05)。细胞释放实验结果如图 2所示,RAW264.7细胞对99Tcm-DTPA-CB86的摄取随着时间的延长而减少,4.5 h时的摄取率为(33.31±2.34)%,8 h时为(19.32±2.01)%,减少了13.99%。

      图  1  RAW264.7巨噬细胞对99Tcm-DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)-CB86的摄取曲线(n=3)

      Figure 1.  In vitro uptake of 99Tcm-DTPA-CB86 in RAW264.7 cells (n=3)

      图  2  RAW264.7巨噬细胞对99Tcm-DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)-CB86的摄取曲线(n=3)

      Figure 2.  In vitro uptake of 99Tcm-DTPA-CB86 in RAW264.7 cells (n=3)

    • 尾静脉注射示踪剂后,除了左踝关节炎症组织外,99Tcm-DTPA-CB86在各组织器官中的放射性分布随着时间的延长逐渐下降(表 1)。左踝关节炎症组织的放射性分布0.5 h时为(1.33±0.16)%ID/g,3 h时为最高值(2.35 ± 0.10)%ID/g;肝脏0.5 h时为最高值(5.56 ± 0.76)%ID/g,3 h时仍有较高的摄取,为(2.14 ± 0.23)%ID/g;血液中0.5 h时为(0.78 ± 0.07)%ID/g,3 h时为(0.56 ± 0.09)%ID/g。A/B和A/M的放射性比值随时间的延长逐渐增高,0.5 h时分别为(1.71 ± 0.05)和(1.32 ± 0.43),3 h时为(4.19 ± 0.21)和(3.01 ± 0.16)。

      组织或器官注射后时间/h
      0.51.53
      1.49±0.170.46±0.060.33±0.05
      5.56±0.763.82±0.972.14±0.23
      1.51±0.141.80±0.330.68±0.16
      2.03±0.251.86±0.381.71±0.28
      1.24±0.430.91±0.080.58±0.03
      2.76±0.361.77±0.311.34±0.21
      0.51±0.160.49±0.090.41±0.07
      肌肉1.01±0.121.47±0.120.78±0.02
      小肠3.48±0.592.83±0.631.97±0.28
      血液0.78±0.070.68±0.080.56±0.09
      左踝关节炎症部位1.33±0.162.01±0.182.35±0.10

      表 1  99Tcm-DTPA-CB86在左踝关节炎症小鼠体内的生物学分布[x± s(%ID/g)](n= 4)

      Table 1.  Biodistribution for 99Tcm-DTPA-CB86 in mice models of arthritis[x± s %ID/g)] (n = 4 for each group)

    • 左踝关节炎症小鼠注射99Tcm-DTPA-CB86后Micro SPECT/CT显像结果如图 3图 4所示。未阻断组注射99Tcm-DTPA-CB86后0.5 h时左踝关节炎症部位可见放射性分布,且随时间的延长逐渐增浓,3 h时炎症部位显像最清晰(图 3),而正常组织的放射性分布随时间的延长逐渐减淡;竞争性抑制组始终未见明显的炎症部位显影(图 4)。

      图  3  未阻断组左踝关节炎症小鼠注射99Tcm-DTPA-CB86后不同时间的Micro SPECT/CT显像图(方框示左踝关节炎症)

      Figure 3.  Micro SPECT/CT imaging of 99Tcm-DTPA-CB86 in mice models of arthritis in the unblocked group at various times after injection (box showing left arthritis)

      图  4  竞争性抑制组左踝关节炎症小鼠注射99Tcm-DTPA-CB86后不同时间的Micro SPECT/CT显像图(方框示左踝关节炎症)

      Figure 4.  Micro SPECT/CT imaging of 99Tcm-DTPA-CB86 in mice models of arthritis in the blocked group at various times after injection (box showing left arthritis)

    • CB86是一种新型TSPO拮抗剂,其IC50(半抑制浓度)(1.2 nmol/L)比TSPO特异性拮抗剂PK 11195(2.2 nmol/L)低[12],这表明CB86对TSPO的特异性较强。CB86分子上带有氨基,且对温度和pH值有较高的耐受性,适合在特异性结合位点上进行化学修饰,且其在连接显像或治疗的药效基团后仍对TSPO有很高的亲和性。Musacchio等[13]报道在含有紫杉醇PEG-PE(聚乙二醇磷脂酰乙醇胺)微球上修饰CB86(13.6 μmol/L)能大大增强紫杉醇的抗癌效果。TSPO作为线粒体外膜的重要组成部分,参与线粒体膜渗透性转换孔的开放,调控细胞的凋亡[1]。CB86分子不能直接用于99Tcm标记,需引入双功能螯合剂,DTPA在较低的配体浓度下即对99Tcm111In等金属核素有很高的标记率[14]。本研究中笔者先将CB86与DTPA偶联,制成DTPA-CB86,再进行99Tcm标记获得99Tcm-DTPA-CB86,且经放射性HPLC结果证实放化纯度较好。另外,99Tcm-DTPA-CB86的体外稳定性较好,放置4 h未出现放化纯度降低,有利于进行远距离配送。

      体外细胞研究结果显示:小鼠RAW264.7巨噬细胞对99Tcm-DTPA-CB86的特异性摄取率在3 h时达到最高峰[(36.45 ± 2.18)%],但同时加入过量未标记的DTPA-CB86后,细胞的摄取率显著下降;RAW264.7细胞对99Tcm-DTPA-CB86的摄取随着时间的延长而略有减少,4.5 h时摄取率为(33.31 ± 2.34)%,8 h时为(19.32 ± 2.01)%,减少13.99 %,这表明99Tcm-DTPA-CB86可以特异性地与小鼠RAW264.7巨噬细胞的TSPO结合,且亲和力高,外排少。

      99Tcm-DTPA-CB86在左踝关节炎症小鼠体内的生物学分布和Micro SPECT/CT显像的研究结果表明,显像剂99Tcm-DTPA-CB86在小鼠体内的稳定性尚好,随时间延长左踝关节炎症部位仍有较高摄取,而正常组织如肝、血液、肌肉等的摄取逐渐降低,提高了A/B和A/M的放射性比值以及炎症的检出率。注射后0.5 h时左踝关节炎症部位已略见显影,3 h时炎症部位摄取仍可达(2.35 ± 0.10)%ID/g,这表明99Tcm-DTPA-CB86在炎症部位中的清除率较慢且停留时间较长,有利于炎症的显像。肝、血液、肌肉中的放射性随时间延长逐渐减低,A/B和A/M的放射性比值分别从0.5 h时的(1.71 ± 0.05)和(1.32 ± 0.43)增高至3 h时的(4.19 ± 0.21)和(3.01 ± 0.16),这表明99Tcm-DTPA-CB86在血液、肌肉等非炎症组织中的清除率较快(主要从肝脏代谢),A/B和A/M的放射性比值随时间延长逐渐增高,炎症显像更清晰,提示99Tcm-DTPA-CB86在左踝关节炎症小鼠模型中的靶向性良好,且在体内的停留时间长。在竞争性抑制实验中各时间段均未见炎症显影,未标记DTPA-CB86明显抑制了99Tcm-DTPA-CB86与炎症巨噬细胞的TSPO的结合,这表明显像剂99Tcm-DTPA-CB86能够与TSPO特异性结合。

      综上所述,我们成功制备的99Tcm-DTPA-CB86可与巨噬细胞特异性结合,且经标记后保留了生物学活性。小鼠体内分布及SPECT/CT显像结果表明,其有望成为一种应用于关节炎症的SPECT显像的分子显像剂。

参考文献 (14)

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