PET/CT显像剂18F-氟丙酸在肝癌中的生物学评估

赵竞 张占文 马慧 聂大红 蒋宁一 刘生 唐刚华

引用本文:
Citation:

PET/CT显像剂18F-氟丙酸在肝癌中的生物学评估

    通讯作者: 刘生, liusheng_gz@126.com ; 唐刚华, gtang0224@126.com
  • 基金项目:

    广州市科技计划基金 201510010145

    广东省科技计划基金 2013B021800264

    广东省科技计划基金 2016B090920087

    国家自然科学基金 81671719

    广州市科技计划基金 201604020169

    国家自然科学基金 81571704

Biological evaluation of PET/CT imaging agent 18F-fluoropropionic acid in hepatocellular carcinoma

    Corresponding author: Sheng Liu, liusheng_gz@126.com ;Ganghua Tang, gtang0224@126.com
  • Fund Project: Science and Technology Planning Project Foundation of Guangzhou 201510010145Science and Technology Foundation of Guangdong Province 2013B021800264Science and Technology Foundation of Guangdong Province 2016B090920087National Natural Science Foundation of China 81671719Science and Technology Planning Project Foundation of Guangzhou 201604020169National Natural Science Foundation of China 81571704

  • 摘要: 目的 探讨PET/CT显像剂18F-氟丙酸(18F-FPA)对肝细胞肝癌(HCC)的显像效果及其摄取机制。方法 (1)以甲基-2-溴丙酸乙酯为前体合成18F-FPA;(2)通过体外细胞摄取实验测定人肝癌SK-Hep 1细胞不同时间点对18F-FPA的放射性摄取情况;观察不同浓度脂肪酸合成酶抑制剂-奥利司他(Orilistat)、乙酰辅酶A羧化酶抑制剂5-十四烷氧基-2-呋喃甲酸(TOFA)对18F-FPA的摄取抑制情况;(3)对荷人肝癌SK-Hep 1小鼠行18F-FPA microPET/CT显像,并与18F-FDG PET/CT显像进行比较。18F-FPA和18F-FDG在肿瘤中的放射性摄取率比较采用t检验。结果 (1)18F-FPA的合成产率为(45±2)%。(2)细胞摄取实验结果显示,人肝癌SK-Hep 1细胞对18F-FPA的摄取率从5 min的(1.3±0.4)%上升到120 min的(4.6±0.2)%。细胞摄取抑制实验结果显示,随着抑制剂浓度的增高,人肝癌SK-Hep 1细胞对18F-FPA的摄取逐渐降低。当抑制剂奥利司他和TOFA浓度均为400 μmol时,人肝癌SK-Hep 1细胞对18F-FPA的摄取率分别降低了(40.3±4.0)%和(26.0±6.0)%。(3)荷人肝癌SK-Hep 1小鼠18F-FPA microPET/CT显像显示了快速且准确的肿瘤定位,肿瘤/肝脏比值为1.63±0.26;18F-FDG PET/CT显像中的肿瘤/肝脏比值为1.09±0.21。18F-FPA比18F-FDG具有更好的显像效果,差异有统计学意义(t=4.055,P=0.047)。结论18F-FPA可用于肝癌显像,且其摄取与脂肪酸合成有关。
  • 图 1  不同时间点人肝癌SK-Hep 1细胞对18F-氟丙酸的摄取率

    Figure 1.  The cellular uptake rate of 18F-fluoropropionic acid by human hepatocellular carcinoma SK-Hep 1 cells at different time points

    图 2  不同浓度抑制剂奥利司他和TOFA对18F-FPA在人肝癌SK-Hep 1细胞中的摄取抑制作用

    Figure 2.  Different concentrations of Orilistat and TOFA presented a inbibitive effect on of 18F-fluoropropionic acid in SK-Hep 1 cells

    图 3  18F-FDG和18F-FPA在荷人肝癌SK-Hep 1小鼠中的micro PET/CT显像图

    Figure 3.  micro PET/CT imaging of 18F-FDG and 18F-fluoropropionic acid in human hepatocellular carcinoma SK-Hep 1 mice

    图 4  人肝癌SK-Hep 1细胞肿瘤组织病理图(苏木精-伊红染色,×200)

    Figure 4.  Histopathology of SK-Hep 1 tumor tissue(HE, ×200)

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出版历程
  • 收稿日期:  2018-05-23
  • 刊出日期:  2018-09-25

PET/CT显像剂18F-氟丙酸在肝癌中的生物学评估

    通讯作者: 刘生, liusheng_gz@126.com
    通讯作者: 唐刚华, gtang0224@126.com
  • 1. 510120 广州, 中山大学孙逸仙纪念医院, 广东省恶性肿瘤表观遗传与基因调控重点实验室/核医学科
  • 2. 510655 广州, 中山大学附属第六医院核医学科
  • 3. 510080 广州, 中山大学附属第一医院核医学科
  • 4. 510080 广州, 中山大学附属第一医院放疗科
基金项目:  广州市科技计划基金 201510010145广东省科技计划基金 2013B021800264广东省科技计划基金 2016B090920087国家自然科学基金 81671719广州市科技计划基金 201604020169国家自然科学基金 81571704

摘要: 目的 探讨PET/CT显像剂18F-氟丙酸(18F-FPA)对肝细胞肝癌(HCC)的显像效果及其摄取机制。方法 (1)以甲基-2-溴丙酸乙酯为前体合成18F-FPA;(2)通过体外细胞摄取实验测定人肝癌SK-Hep 1细胞不同时间点对18F-FPA的放射性摄取情况;观察不同浓度脂肪酸合成酶抑制剂-奥利司他(Orilistat)、乙酰辅酶A羧化酶抑制剂5-十四烷氧基-2-呋喃甲酸(TOFA)对18F-FPA的摄取抑制情况;(3)对荷人肝癌SK-Hep 1小鼠行18F-FPA microPET/CT显像,并与18F-FDG PET/CT显像进行比较。18F-FPA和18F-FDG在肿瘤中的放射性摄取率比较采用t检验。结果 (1)18F-FPA的合成产率为(45±2)%。(2)细胞摄取实验结果显示,人肝癌SK-Hep 1细胞对18F-FPA的摄取率从5 min的(1.3±0.4)%上升到120 min的(4.6±0.2)%。细胞摄取抑制实验结果显示,随着抑制剂浓度的增高,人肝癌SK-Hep 1细胞对18F-FPA的摄取逐渐降低。当抑制剂奥利司他和TOFA浓度均为400 μmol时,人肝癌SK-Hep 1细胞对18F-FPA的摄取率分别降低了(40.3±4.0)%和(26.0±6.0)%。(3)荷人肝癌SK-Hep 1小鼠18F-FPA microPET/CT显像显示了快速且准确的肿瘤定位,肿瘤/肝脏比值为1.63±0.26;18F-FDG PET/CT显像中的肿瘤/肝脏比值为1.09±0.21。18F-FPA比18F-FDG具有更好的显像效果,差异有统计学意义(t=4.055,P=0.047)。结论18F-FPA可用于肝癌显像,且其摄取与脂肪酸合成有关。

English Abstract

  • 近几十年来,原发性肝癌的全球发病率逐渐上升,早期发现和诊断对其治疗及预后至关重要。与大多数恶性肿瘤相比,肝癌的诊断可以完全依据影像学表现。然而,推荐用于病灶成像的增强CT或MRI的灵敏度较低,分别为76%和61%[1]18F-FDG PET可为肝脏手术、移植和姑息治疗提供有价值的预后信息,但在肝细胞癌的诊断中作用有限[2-3]。乙酸盐和胆碱能显像剂对18F-FDG显像具有重要的互补作用[4]。虽然11C-乙酸盐的摄取机制尚不清楚,但最新研究发现大多数前列腺肿瘤脂肪酸合成代谢活跃,推测这是由于肿瘤中11C-乙酸盐摄取增加,即以乙酸盐为底物合成短链脂肪酸[5]11C-乙酸盐在肝癌成像方面显示出很好的前景,但是11C的半衰期(20.4 min)短,限制了它的广泛应用。为此,开发了18F-氟乙酸(18F-fluoroacetic acid, 18F-FAC)作为11C-乙酸盐的替代物。18F-FAC的缺点在于其被骨骼大量吸收,放射性示踪剂的脱氟特性限制了它的使用[6-7]。因此,需要开发或寻找新的PET示踪剂以克服现有的缺点或补充现有的示踪剂。因此,我们制备了18F-氟丙酸(18F-fluoropropionic acid, 18F-FPA),探讨18F-FPA在人肝癌SK-Hep 1细胞中的摄取情况和在荷肝癌肿瘤模型中的显像效果,并对其摄取机制进行了初步探索。

    • 人肝癌SK-Hep 1细胞系来自中国科学院细胞库(上海),无特定病原体级雄性Bclb/c裸鼠,4~6周龄,体质量20~25 g,购自广州中山大学医学院实验动物中心。4,7,13,16,21,24-六氧-1,10-二氮双环[8.8.8]二十六烷(K222)购自法国ABX公司;乙腈和二甲基亚砜(DMSO)购自美国Aldrich公司;甲基-2-溴丙酸乙酯购自阿拉丁试剂(上海)有限公司;奥利司他(Orilistat)购自美国Sigma-Alrich公司;5-十四烷氧基-2-呋喃甲酸(5-Tetradecyloxy-2-furoic acid, TOFA)购自美国Cayman Chemical公司;其余试剂均为国产分析纯或化学纯。Sep Pak QMA、C18 plus柱购自美国Waters公司;micro PET/CT显像仪购自德国Bruker公司,由中山大学中山医学院实验平台提供。

    • 人肝癌SK-Hep 1细胞培养基使用DMEM,采用含10%胎牛血清,于37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。培养基每周例行更换3次,选择处于指数增长的肿瘤细胞用于实验。所有实验均在中山大学动物实验中心批准的方案下进行,常规消毒后每只Bclb/c裸鼠腋窝皮下注射5×106个/mL肿瘤细胞100 μL,其中含细胞培养悬液50 μL、基质胶50 μL。荷人肝癌SK-Hep 1小鼠在无特定病原体级环境中培养,食物充足。每周测量2次体质量和肿瘤体积。待肿瘤体积长到500~1000 mm3时进行实验。

    • 18F-FPA的合成是基于文献[8]和既往的合成方法。回旋加速器通过180(p,n)18F核反应生产得到18F离子,18F离子通过QMA柱俘获后用K222溶液淋洗到反应瓶中;利用氮气在116 ℃加热条件下除去溶剂;将甲基-2-溴丙酸乙酯加入含有[18F]KF/K222的反应瓶中,在密闭的反应管内加热至100 ℃并持续15 min。冷却后,用8 mL水将中间体挂在HLB柱子上。用2 mol/L的NaOH通过HLB固相萃取小柱,室温下水解5 min。用1 mL灭菌水通过HLB-Al2O3-SCX柱将产品洗至产品瓶中,调节pH值至中性或弱酸性,用生理盐水配成溶液通过0.22 μm无菌滤膜后使用。使用高效液相色谱测定18F-FPA的放射性化学纯度。

    • 将人肝癌SK-Hep 1细胞悬液于实验前一天铺于24孔板中(1×107个/孔),将细胞培养基倒掉,用PBS清洗细胞2次,加入18F-FPA(约2 mL,0.074 MBq/孔),于37℃、5%CO2细胞培养箱分别孵育5、30、60、90和120 min后,用PBS冲洗细胞2次,再加入1 mol/L的NaOH 500 μL,裂解20 min,收集细胞裂解液,用γ计数仪测细胞放射性活度。结果以平均值±标准差表示,每次实验重复4次。

      $ 细胞摄取率 = \frac{细胞摄取剂量}{注入总剂量} \times 100\% $

    • 将人肝癌SK-Hep 1细胞悬液接种于24孔板,于37℃、5%CO2培养箱中孵育1 d,将细胞培养基倒掉,用PBS清洗2次,然后将细胞悬液分为对照组和实验组,对照组加入200 μL PBS;实验组共分为5组,分别加入不同浓度梯度(25、50、100、200、400 μmol/L)的抑制剂奥利司他或TOFA 200 μL,孵育30 min后加入18F-FPA(约2 mL,0.074 MBq/孔),孵育60 min后用PBS冲洗细胞2次,用1 mol/L NaOH 500 μL,裂解20 min,收集细胞裂解液,用γ计数仪测细胞放射性活度。结果以平均值±标准差表示,每次实验重复4次。实验组得出的数据与对照组相比,观察在不同浓度的抑制剂条件下细胞对18F-FPA的摄取抑制情况。

    • 将荷人肝癌SK-Hep 1小鼠禁食4 h,小鼠在注射放射性示踪剂前用2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉,并在整个研究过程中保持麻醉状态,然后经尾静脉给予100~120 μL 18F-FPA溶液,约3.70~4.44 MBq。给药60 min后行全身microPET/CT显像。先行15 min的静态PET扫描,然后用CT扫描对病变部位进行校正和定位。同一只荷人肝癌SK-Hep 1小鼠,完成18F-FPA显像后放置24 h,在与18F-FPA同样的注射剂量、扫描条件下给小鼠尾静脉注射18F-FDG进行显像。使用Albira PET系统和PMOD 3.7版软件进行图像重建,由2名核医学科医师在肿瘤和肌肉组织上绘制ROI,获得肿瘤及组织器官的每克组织百分注射剂量率(ID%/g值),并对所获得的数据进行分析。

    • PET/CT显像完成后,处死荷人肝癌SK-Hep 1小鼠,分离肿瘤组织,用冷的PBS溶液冲洗细胞3次,部分肿瘤组织用4%甲醛溶液浸泡,然后用石蜡切片,每片厚5 μm,脱蜡、水化,苏木精染色5 min后伊红染色2 min,在光学显微镜下观察肿瘤细胞形态。

    • 应用SPSS18.0软件进行统计学分析。所有数据均用平均数±标准差(x±s)表示,计数数据符合正态分布且方差齐,18F-FPA和18F-FDG在肿瘤中的放射性摄取率的比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

    • 18F-FPA的合成在40 min内完成,经高效液相色谱分析测定,产物的放射性化学纯度>95%,比活度>37 GBq/μmol,合成最终产率为(45±2)%。

    • 18F-FPA在人肝癌SK-Hep 1细胞中的摄取率从5 min的(1.3±0.4)%上升到120 min的(4.6±0.2)%,30~60 min放射性摄取增加速度最快(图 1)。不同浓度梯度抑制剂奥利司他和TOFA分别对人肝癌SK-Hep 1细胞摄取抑制的实验结果见图 2。由图 2可见,随着抑制剂浓度的增高,人肝癌SK-Hep 1细胞的放射性摄取率表现出逐渐降低的趋势。与对照组比较,当抑制剂奥利司他和TOFA的浓度分别为400 μmol/L时,人肝癌SK-Hep 1细胞对18F-FPA的摄取率分别下降了(40.3±4.0)%和(26.0±6.0)%。

      图  1  不同时间点人肝癌SK-Hep 1细胞对18F-氟丙酸的摄取率

      Figure 1.  The cellular uptake rate of 18F-fluoropropionic acid by human hepatocellular carcinoma SK-Hep 1 cells at different time points

      图  2  不同浓度抑制剂奥利司他和TOFA对18F-FPA在人肝癌SK-Hep 1细胞中的摄取抑制作用

      Figure 2.  Different concentrations of Orilistat and TOFA presented a inbibitive effect on of 18F-fluoropropionic acid in SK-Hep 1 cells

    • 荷人肝癌SK-Hep 1小鼠注射18F-FPA后行microPET/CT显像结果见图 3。由图 3可见,静脉注射18F-FPA 60 min后,microPET/CT显像显示在荷人肝癌SK-Hep 1小鼠中表现出快速且准确的肿瘤定位,相应的肿瘤摄取值为(8.15±0.13)%ID/g,肿瘤/肝放射性比值为1.63±0.26。18F-FDG PET/CT显像中,肿瘤摄取值为(3.25±0.50)%ID/g,肿瘤/肝放射性比值为1.09±0.21。18F-FPA的肿瘤/肝放射性比值高于18F-FDG,差异有统计学意义(t=4.055,P=0.047)。

      图  3  18F-FDG和18F-FPA在荷人肝癌SK-Hep 1小鼠中的micro PET/CT显像图

      Figure 3.  micro PET/CT imaging of 18F-FDG and 18F-fluoropropionic acid in human hepatocellular carcinoma SK-Hep 1 mice

    • 人肝癌SK-Hep 1细胞肿瘤组织病理图见图 4。图中可见大量异性细胞,证明成功建立了肿瘤动物模型。

      图  4  人肝癌SK-Hep 1细胞肿瘤组织病理图(苏木精-伊红染色,×200)

      Figure 4.  Histopathology of SK-Hep 1 tumor tissue(HE, ×200)

    • 物质代谢异常是恶性肿瘤的重要标志,除了已知的糖酵解外,恶性肿瘤会有脂质代谢紊乱的表现[9-10]。放射性核素标记的小分子,如葡萄糖、乙酸酯、FAC已被广泛用于各种肿瘤的检测,包括肝癌、前列腺癌和乳腺癌等[11-13]18F-FDG PET可为肝脏手术、移植和姑息治疗提供有价值的预后信息,但其在肝癌诊断中的作用有限[16]11C-乙酸酯和11C-胆碱PET对肝细胞肝癌的诊断有较高的灵敏度,在18F-FDG PET/CT中联合11C-乙酸酯和11C-胆碱显像可提高诊断原发性肝癌的整体灵敏度,但也存在一些缺点和局限性。本研究对短烷基羧酸18F-FPA进行了实验研究,结果表明,18F-FPA合成简便,产率高,是一种非常有前景的肿瘤PET显像剂。本研究结果与以往研究结果相符合[15-18]

      丙酸钠、钾和钙盐通常被广泛用于食品添加剂。代谢研究表明,丙酸可作为脂肪酸、糖原、氨基酸等合成的前体。有研究结果显示,丙酸可取代乙酸,成为心脏和肿瘤细胞首选的能量基质[18]。丙酸首先由线粒体丙酰基-辅酶A合成酶催化转变为丙酰基辅酶A,这是脂肪酸代谢的第一个共同步骤[19]。在本研究的抑制细胞实验中,我们推断18F-FPA可能有类似于18F-FAC的代谢机制,参与脂肪酸代谢。奥利司他和TOFA分别抑制脂肪酸合成酶、乙酰辅酶A羧化酶[20-22]。奥利司他可以特异性地抑制脂肪酸合成酶,它对不同的肿瘤细胞的增殖有潜在的抑制作用,并可抑制肿瘤的生长[23-25]。TOFA对肝细胞、大鼠肝脏或雄性大鼠肝脏的脂肪酸合成有抑制作用,降低内源性脂肪酸从而对细胞膜磷脂组分产生影响。已有研究证明,TOFA对肺癌、结肠癌和前列腺癌细胞均有细胞毒性[26-27]。在本研究中,脂肪酸合成关键酶抑制剂能够不同程度地抑制18F-FPA在人肝癌SK-Hep 1细胞中的摄取,证明18F-FPA的摄取参与脂肪酸代谢途径。

      本研究中,18F-FPA的体外细胞摄取及荷人肝癌SK-Hep 1小鼠PET/CT显像结果表明,18F-FPA在人肝癌SK-Hep 1细胞中具有较高地摄取,且可清晰地显示肿瘤。与传统显像剂18F-FDG相比,18F-FPA具有更好的显像效果,是一种具有前景的肿瘤PET/CT显像剂。

参考文献 (27)

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