Volume 43 Issue 6
Jan.  2020
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Application of nanotechnology for diagnosis of Alzheimer's disease

  • Alzheimer's disease (AD) is a common neurodegenerative disorder, which is clinically characterized by progressive cognitive deficit and memory impairment. It seriously affects mental health, physical activity, and quality of life of patients in the late stage. However, early diagnosis of AD remains one of the greatest challenges worldwide. Extracellular amyloid-β (Aβ) plaques composed of Aβ and intraneuronal neurofibrillary tangles consisting of hyperphosphorylated Tau proteins are considered as the key pathological hallmarks of AD. Detection of Aβ and Tau protein is considered critical for the early diagnosis of AD. In recent decades, nanotechnology has developed rapidly, and nanotechnology-based Aβ- or Tau-targeted detection has provided the possibility for the early diagnosis of AD. The present review focuses on the research of nanotechnology in the diagnosis of AD.
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通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
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    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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Application of nanotechnology for diagnosis of Alzheimer's disease

    Corresponding author: Mingrong Zhang, zhang.ming-rong@qst.go.jp
    Corresponding author: Hong Zhang, hzhang21@zju.edu.cn
  • 1. Department of Nuclear Medicine, the Second Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310009, China
  • 2. Zhejiang University Medical PET Center, Hangzhou 310009, China
  • 3. National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology, Chiba 263-8555, Japan
  • 4. Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China
  • 5. Key Labratory for Biomedical Engineering of Ministry of Education, Zhejiang University, Hangzhou 310009, China
  • 6. The College of Biomedical Engineering and Instrument Science of Zhejiang University, Hangzhou 310009, China

Abstract: Alzheimer's disease (AD) is a common neurodegenerative disorder, which is clinically characterized by progressive cognitive deficit and memory impairment. It seriously affects mental health, physical activity, and quality of life of patients in the late stage. However, early diagnosis of AD remains one of the greatest challenges worldwide. Extracellular amyloid-β (Aβ) plaques composed of Aβ and intraneuronal neurofibrillary tangles consisting of hyperphosphorylated Tau proteins are considered as the key pathological hallmarks of AD. Detection of Aβ and Tau protein is considered critical for the early diagnosis of AD. In recent decades, nanotechnology has developed rapidly, and nanotechnology-based Aβ- or Tau-targeted detection has provided the possibility for the early diagnosis of AD. The present review focuses on the research of nanotechnology in the diagnosis of AD.

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  • 阿尔兹海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种起病隐匿、进行性发展的神经退行性疾病,临床表现以进行性认知功能障碍、执行功能减退以及人格行为异常改变等脑功能损伤为特征,严重制约患者的日常生活、职业与社交能力[1]。《2018年世界阿尔茨海默病报告》指出[2],截至2018年,全球约有5千万人患有痴呆症;随着人口老龄化的加剧,全球每3秒就有1例新发病例,预计至2050年,患者总数将达1.5亿;而在所有痴呆症患者中,AD患者约占2/3,给家庭和社会带来沉重的负担。

    目前,AD早期诊断仍是全球面临的重大难题之一。临床上,AD的诊断通常基于认知功能测试、神经学检测、一般体格检查和常规实验室分析等检查[3]。然而,在AD患者认知减退等临床症状出现前15~20年,其病理生理改变已发生。目前普遍认为,AD的进展有两个关键阶段:临床前阶段和临床阶段。在临床前阶段,与AD发病相关的生物标志物,如β淀粉样肽(amyloid-β,Aβ)和异常Tau蛋白已出现,但尚不足以诱发神经元死亡或痴呆症状[4]。因此,AD早期生物标志物检测对实现AD的早期诊断和个体化治疗方案的制定至关重要。

    近几十年来,纳米技术发展迅速,在AD的早期诊断和个体化治疗中具有潜在应用前景[5]。纳米技术可在纳米级别(即十亿分之一米)对纳米材料进行控制或操纵,以实现其独特的功能特性[6]。由于纳米材料表面原子和(或)分子的排列和间距不同,其性质与相应宏观尺度上的同等材料有明显差异。纳米材料在AD生物标志物的研究和早期诊断等方面具有潜力和优势[7]:改进和修饰后的纳米材料可以通过分子间的相互作用靶向受损细胞或组织;同时,表面携带功能化配体的纳米材料可以穿透血-脑屏障(blood brain barrier,BBB),并有更长的生物半衰期等。

    笔者对AD的病理机制进行简要概述,并就纳米技术在AD早期诊断的研究进展进行综述,为纳米医学在AD的临床转化提供方向和引导。

1.   AD的病理机制
  • Aβ过度沉积形成的细胞外Aβ斑块和过度磷酸化Tau蛋白异常折叠聚集形成的细胞内神经原纤维缠结为AD的两大标志性病理特征[8]。AD的病因和发病机制复杂,目前尚未阐明。但在过去30年的研究中,大量证据表明Aβ异常沉积和Tau蛋白异常缠结与AD患者的神经退行性过程密切相关[9-10]

    Aβ作为AD的病因最有力的证据来自家族性AD的研究,研究显示,家族性AD患者常伴随21号染色体上编码淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)、14号染色体上编码早老素1(presenilin 1,PS1)或者1号染色体上编码PS2的基因突变[11]。其中,APP是Aβ的前体,APP基因突变干扰Aβ的裂解和聚集。PS1和PS2为裂解APP的γ分泌酶提供α催化亚基。PS基因突变最初被认为会导致Aβ 42的增加,Szaruga等[12]研究发现,PS基因的突变可以导致APP加工效率降低,产生更多长链疏水性Aβ。Aβ被认为是AD发生的触发因素甚至是驱动因素,其产生和清除的失平衡引起的Aβ沉积在AD的发病中起着关键作用[13]。“Aβ级联假说”由此提出,假说主张Aβ的异常触发AD病理改变发生,并导致后续的Tau蛋白聚集缠结、突触损伤、神经元死亡和认知障碍[14]

    Tau蛋白是一种高度可溶性的、天然非折叠状的微管相关蛋白,主要分布于轴突,与正常微管蛋白结合并促进其聚合形成微管,维持微管的稳定性[15]。在AD患者脑内,Tau蛋白发生过度磷酸化,使其与微管蛋白的结合力下降为正常Tau蛋白的1/10;同时,过度磷酸化的Tau蛋白发生错误折叠并异常聚集,形成非可溶性双螺旋丝或神经原纤维缠结,与正常Tau蛋白及微管相关蛋白竞争性结合微管蛋白,进一步导致微管解聚,破坏正常微管系统,干扰正常轴突转运和连接,最终引起神经元功能损伤乃至神经元死亡[10]。虽然在“Aβ级联假说”中,Tau蛋白的病理改变被认为是Aβ沉积的下游事件,但是,现有研究提示Tau蛋白和Aβ处于两条并列途径,两者可能由同一上游因素驱动,相互作用,加剧彼此的神经毒性,共同诱发AD[16]。研究认为,与朊病毒病相似,异常构象的Aβ和(或)Tau蛋白在AD发展过程中起着类似朊蛋白的作用,其可作为毒性种子,诱导正常肽发生同样的错误折叠,从而导致异常构象的肽在全脑范围内散播[17-18]

2.   基于纳米技术的Aβ靶向检测
  • Aβ聚集沉积被认为是AD早期病理生理改变的关键因素[14],目前,Aβ已成为AD早期诊断的重要靶点。基于纳米技术的Aβ靶向检测的研究主要集中于脑脊液或生理溶液(如血浆、缓冲盐溶液、生理盐水等)中Aβ的体外检测以及靶向Aβ斑块的在体神经成像(表1),在AD早期诊断中具有良好的应用前景。

    纳米材料靶向配体模型作用机制检测方式给药途径BBB穿透力
    Au NPs[20] Aβ40溶液 AuNPs的SPR对Aβ40的数量敏感 SPR
    LIP-NPs[21] 磷脂酸和心磷脂 Aβ1-42溶液 磷脂酸和心磷脂结合Aβ斑块 SPR
    纳米脂质体[22] 姜黄素 Aβ1-42溶液 姜黄素结合Aβ斑块 SPR
    纳米脂质体[23] Aβ单克隆抗体 Aβ单体 Aβ单克隆抗体结合Aβ斑块 SPR
    PBCA -NPs[24] 125I-CQ APP/PS1转基因小鼠 125I-CQ结合Aβ斑块 放射自显影 尾静脉注射 穿透BBB
    USPIO NPs[25] Aβ1-42肽 APP/PS1转基因小鼠 Aβ1-42肽结合Aβ斑块;USPIO增加MRI像对比度 MRI 股静脉注射 颈动脉注射甘露醇提高BBB穿透力
    Gd-DTPA[26] Aβ1-40肽 APP/PS1转基因小鼠 Aβ1-40肽结合Aβ斑块;Gd-DTPA增加μMRI成像对比度 μMRI 颈动脉注射 颈动脉注射甘露醇提高BBB穿透力
    MION[27] Aβ1-40肽 APP/PS1转基因小鼠 Aβ1-40肽结合Aβ斑块;MION增加μMRI成像对比度 μMRI 颈动脉注射 颈动脉注射甘露醇提高BBB穿透力
    Gd-DTPA[28] K6Aβ1-30肽 APP/PS1转基因小鼠 Aβ1-30肽结合Aβ斑块;Gd-DTPA增加μMRI成像对比度 μMRI 颈动脉注射 颈动脉注射甘露醇提高BBB穿透力
    PA-LIP[29] 磷脂酸 溶液、体外BBB模型 磷脂酸结合Aβ斑块 SPR RI7217提高BBB穿透力
    PEG-PLA NPs[30] QSH ICR小鼠 QSH肽结合Aβ斑块 荧光成像 尾静脉注射 TGN提高BBB穿 透力
    MZF[31] PiB ICR小鼠 PiB结合Aβ斑块;MZF增加MRI成像对比度 MRI 尾静脉注射
    USPIO NPs[32] Aβ1-42肽 APP/PS1转基因小鼠 Aβ1-42肽结合Aβ斑块;USPIO增加μMRI成像对比度 μMRI 股静脉注射 PEG修饰提高BBB穿透力
    Fe3O4@SiO2@SLCONHR NPs[33] SLCOOH APP/PS1转基因小鼠 SLCOOH结合Aβ斑块并作为NIRI探针;Fe3O4增加MRI成像对比度 NIRI/MRI 尾静脉注射 穿透BBB
    注:表中,BBB:血-脑屏障;Au:金;NPs:纳米粒;LIP:脂质;Aβ:amyloid-β;SPR:表面等离子共振;PBCA:聚正丁基-2-氰基丙烯酸酯;125I-CQ:125 I-氯喹诺酮;APP:β淀粉样前体蛋白基因;PS1:早老素1基因;USPIO NPs:超小超顺磁性氧化铁纳米粒;MRI:磁共振成像;Gd-DTPA:钆-二乙胺乙酸;μMRI:磁共振显微成像;MION:单晶硅氧化物纳米粒;PA-LIP NPs:磷脂酸-脂质纳米粒;RI7217:一种抗转铁蛋白受体抗体;PEG:聚乙二醇;PLA:多聚乳酸;QSH:QSHYRHISPAQVC;TGN:TGNYKALHPHNGC;MZF:Mn0.6Zn0.4Fe2O4;PiB:匹兹堡化合物B;SLCOOH:卡巴唑型氰基近红外荧光探针;NIRI:近红外荧光成像;。

    Table 1.  Nanotechnology-based Aβ detection

    在各种高灵敏度的脑脊液Aβ检测技术中,Georganopoulou等[19]建立了一种基于金纳米粒(gold nanoparticles,Au NPs)的生物条码测试方法,该方法具有高灵敏度和高效性。通过对30例AD患者脑脊液内Aβ来源的扩散性配体(即潜在可溶性AD致病标记物)的浓度检测,证实该方法的检验精度可高达0.1 mol/L[19]。Elbassal等[20]利用Au NPs的表面等离子体共振(surface plasma resonance,SPR)吸收带强度对Aβ40和 Aβ40突变体低聚物的高度敏感性特点,用于检测Aβ纤维体和低聚物,结果显示,通过探测Au NPs的SPR吸收带强度和SPR强度改变,可半定量检测Aβ40水平并监测Aβ40突变体形成Aβ低聚物的动力学变化,为早期探测Aβ40自组装和纤维聚集体的生成提供可能。同时,利用不同分子,如Aβ结合肽或Aβ的高亲和化合物对NPs表面进行修饰,对实现早期AD检测、疾病进展监测和AD治疗效果评价等具有重要意义。近年来,大量研究使用各种Aβ靶向分子,包括磷脂酸和心磷脂[21](在缓冲盐溶液中对Aβ1-42纤维聚集体的检测精度达22~60 nmol/L)、姜黄素[22](在血浆中对Aβ1-42纤维聚集体的检测精度达1~5 nmol/L)、Aβ单克隆抗体[23](在缓冲盐溶液中对Aβ1-42纤维聚集体的检测精度达500 pmol/L)等对NPs进行表面修饰,提高其对Aβ的亲和力和检测灵敏度。

    基于Aβ斑块靶向的纳米成像探针的开发,对实现在体可视化脑内Aβ斑块分布和AD早期诊断具有重要作用。Roney等[24]125I标记的Aβ高亲和力药物氯碘喹啉(clioquinol,CQ)修饰聚合物正丁基-2-氰基丙烯酸酯(polymeric n-butyl-2-cyanoacrylate,PBCA)NPs表面,进行活体放射自显影成像,研究结果显示,修饰改良后的NPs可以穿透BBB,与转基因小鼠脑内Aβ斑块特异性结合。Aβ,如Aβ1-42、Aβ1-40或Aβ同源体可与Aβ斑块特异性结合,故经Aβ或Aβ同源体表面修饰的磁性纳米材料可成为Aβ靶向的MRI探针。颈动脉注射甘露醇后暂时渗透性开放小鼠BBB,同时经股静脉注射经Aβ1-42肽修饰的超顺磁性氧化铁(ultrasmall superparamagnetic iron oxide,USPIO),可以用于探测转基因AD小鼠脑内Aβ斑块的分布[25]。经颈动脉同时注射甘露醇(暂时性开放BBB)和Aβ1-40磁性标记的钆-二乙胺乙酸(gadolinium-diethylenetriaminepentaacetic acid,Gd-DTPA)[26-27]或单晶硅氧化物纳米颗粒(monocrystalline iron oxide nanoparticles,MION)[27],可用于APP/PS1转基因AD小鼠脑内Aβ斑块的活体MRI成像。Aβ的无毒同源体K6Aβ1-30标记的Gd-DTPA[28]也可作为Aβ斑块的靶向MRI纳米探针,动脉注射该纳米探针,同时颈动脉注射甘露醇暂时性开放BBB,可以实现活体转基因小鼠脑内Aβ斑块分布的可视化。

    Aβ靶向配体和BBB配体的双功能化修饰,可同时增加NPs的Aβ亲和力和BBB穿透力。Salvati等[29]对纳米脂质体表面进行磷脂酸(结合Aβ)和抗转铁蛋白受体抗体RI7217(穿透BBB)双功能化修饰,其中,经RI7217修饰的纳米脂质体能与BBB内皮细胞高表达转铁蛋白受体特异性结合,通过受体介导的内吞作用介导纳米通过主动转运穿透BBB,靶向Aβ聚集体或斑块。结果显示,该双功能化纳米脂质体在体外BBB模型中的穿透力增强,且对Aβ聚集体具有高度亲和力。类似地,经靶向Aβ1-42结合肽(QSHYRHISPAQVC)和靶向BBB配体(TGNYKALHPHNGC)双重修饰的聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)-多聚乳酸(polylactic acid,PLA)NPs可以穿透BBB,与Aβ斑块精准结合,在AD模型小鼠脑中实现亚微摩尔级别的Aβ斑块检测[30]。甲氧基-XO4为高度特异性的Aβ斑块配体,纳米脂质体表面经XO4修饰后,可作为一个靶向Aβ斑块的荧光标志物,经尾静脉注射入APP/PS1小鼠后,该纳米脂质体能够穿透BBB,并与脑实质区和脑血管区的Aβ斑块结合,从而实现Aβ斑块的在体可视化[30]

    Zeng等[31]将Aβ靶向的匹兹堡化合物B(Pittsburgh compound B,PiB)对Mn0.6Zn0.4Fe2O4(MZF)进行修饰,结果显示该修饰后的纳米粒具有良好的稳定性、生物相容性和超顺磁性,可作为Aβ靶向的MRI造影剂与6月龄的转基因AD小鼠脑内Aβ斑块特异性结合。Wadghiri等[32]将Aβ斑块靶向的磁性USPIO-Aβ1-42 NPs进行PEG修饰,提高其BBB穿透力,结果显示,经静脉注射USPIO-PEG-Aβ1-42 NPs可实现转基因AD小鼠脑内活体Aβ斑块MR成像,而且无需同时注射甘露醇等增加BBB渗透性的制剂。

    另有研究将Aβ靶向的特异性卡巴唑型氰基近红外荧光探针(SLCOOH)结合至超顺磁性氧化铁NPs(Fe3O4@SiO2@SLCONHR NPs)上,赋予该NPs近红外荧光成像和MRI的双模态成像能力,结果显示,该探针不仅无毒,且具有高度的BBB穿透力,同时能对抗Aβ诱导的神经毒性,发挥神经保护作用;在APP/PS1转基因小鼠模型中,该纳米探针具有高灵敏度、高特异度和高对比度,可实现模型小鼠脑内Aβ沉积的活体近红外荧光和MR的双模态成像[33]

    因此,纳米技术作为一种富有前景的Aβ靶向探测的新兴技术,可用于溶液和活体动物中Aβ的检测,未来,基于纳米技术的纳米材料的开发和完善对实现精准探测Aβ具有重要意义。

3.   基于纳米技术的Tau蛋白检测
  • Tau蛋白探测也是实现AD早期诊断的重要方法。有研究认为,Tau蛋白的病变水平与AD患者的认知损伤程度密切相关[34]。因此,基于纳米技术的Tau蛋白靶向检测(表2)对实现AD早期诊断具有重要意义。

    纳米材料靶向配体模型作用机制检测方式给药途径BBB穿透力
    Au NPs[35] 单克隆抗Tau蛋白抗体 Tau蛋白溶液 单克隆抗Tau蛋白抗体结合Tau蛋白 双光子瑞利散射方法
    Au NPs[36] 单克隆抗Tau蛋白抗体 人脑脊液 单克隆抗Tau蛋白抗体结合Tau蛋白;寡核苷酸模板用于PCR检测 PCR
    MNPs及Au NPs[37] 多/单克隆抗Tau蛋白抗体 Tau蛋白溶液 多和(或)单克隆抗Tau蛋白抗体结合Tau蛋白 双抗体夹心酶联免疫吸附实验
    CeNC/IONC/MSN-MB[38] T807 Tau病理大鼠 T807结合Tau聚集体 MRI及PET 脑室注射
    注:表中,AuNPs:金纳米粒;BBB:血-脑屏障;PCR:聚合酶链式反应;MNPs:磁性纳米粒;CeNC/IONC/MSN-MB:二氧化铈纳米晶体/氧化铁纳米晶体/介孔二氧化硅纳米粒子-亚甲蓝;MRI:磁共振成像;PET:正电子发射型断层成像。

    Table 2.  Nanotechnology-based Tau detection

    Neely等[35]基于Au NPs的双光子瑞利散射特性,首次将经单克隆抗Tau蛋白抗体修饰的Au NPs用于探测Tau蛋白水平,发现该Au NPs可以高灵敏和高特异地探测Tau蛋白水平(1 pg/mL);而且,Au NPs表面经抗Tau蛋白抗体修饰后,其双光子瑞利散射强度增加约16倍,能够从富含多种蛋白成分的脑脊液中快速轻易地识别Tau蛋白。有研究者将经抗Tau蛋白单克隆抗体和寡核苷酸模板表面修饰的Au NPs用于人脑脊液样本中Tau蛋白的免疫PCR检测,结果显示,与传统的酶联免疫吸附检测方法相比,基于Au NPs的免疫PCR检测方法具有更高的灵敏度[36]。另有研究将经多克隆抗Tau蛋白修饰的Au NPs(识别Tau蛋白)与经单克隆抗Tau蛋白抗体功能化的磁性NPs(表面增强拉曼散射)结合,用于双抗体夹心酶联免疫吸附实验检测Tau蛋白水平,结果显示,基于Au NPs的双抗体夹心酶联免疫吸附检测方法具有超高的灵敏度和选择性,其对Tau蛋白的检测限值甚至低于25 fmol/L[37]。我们团队用具有MRI增强作用的超小氧化铁纳米晶修饰介孔氧化硅表面,同时标记放射性核素68Ga并连接靶向Tau聚集体的配体T807,结果显示,该NPs能有效地结合Tau蛋白聚集体,并通过MRI和PET的双模态成像有效地实现靶向Tau蛋白检测和[38]

    Tau蛋白与早期AD的病理改变密切相关。目前的一些方法,如神经成像、酶联免疫吸附实验和PCR可以检测病理性Tau蛋白,但由于需要高度专业的知识、操作复杂且检测效率较低,这些方法尚未得到广泛的应用[7]。未来,应用纳米技术实现分子水平的Tau蛋白精准检测,对加速NPs临床应用转化和改善AD患者疾病转归具有重要意义。

4.   总结与展望
  • AD是一种常见的神经退行性疾病,起病隐匿,病程长,并且病理过程复杂。目前普遍认为,Aβ的异常沉积和Tau蛋白的异常缠结与AD的发生密切相关,为AD早期的特征性生物标志物。基于纳米技术的纳米材料组装,赋予纳米材料独特的功能和生物学效应,纳米技术的发展为实现脑脊液或生理溶液(如血浆、缓冲盐溶液、生理盐水等)中Aβ或Tau蛋白的体外精准检测以及脑内Aβ或Tau蛋白的活体靶向神经成像开辟了一条新的道路。然而,作为新兴的技术手段,一方面,纳米材料的生物降解、生物分布、生物相容性及长期生物安全性等仍待评估,技术方面需要不断改进;另一方面,纳米材料对AD的诊断应用绝大部分仍处于临床前研究阶段,需要进一步的相关临床数据以促进其临床转化。在不久的将来,随着纳米技术的发展,纳米技术或将成为AD早期诊断的有效工具。

    利益冲突 本研究由署名作者按以下贡献声明独立开展,不涉及任何利益冲突。

    作者贡献声明 张凯负责查阅文献和论文的撰写;施可欣负责论文表格的制作和参考文献格式的修改;金晨涛负责论文的排版和修改;田梅负责命题的提出和论文的审阅;张明荣负责论文的审阅;张宏负责命题的提出和论文的审阅。

Reference (38)

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